Método mejorado para el tratamiento con bisulfito.

Método para la conversión de una base citosina en un ácido nucleico a una base uracilo,

que comprende las etapas de:

a) incubar el ácido nucleico en presencia de iones sulfito de manera que el ácido nucleico se desamina,

b) unir el ácido nucleico desaminado a una fase sólida,

c) lavar opcionalmente el ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida,

d) incubar el ácido nucleico unido a la fase sólida desaminado bajo condiciones alcalinas de manera que el ácido nucleico desaminado se desulfona,

e) lavar opcionalmente el ácido nucleico unido a la fase sólida desaminado y desulfonado, y

f) eluir opcionalmente el ácido nucleico desaminado y desulfonado a partir de la fase sólida.

Método mejorado para el tratamiento con bisulfito.

La presente aplicación se refiere a un método para desarrollar una reacción con bisulfito para determinar las posiciones de metilación en un ácido nucleico, es decir las citosinas metlladas y no metlladas, de manera que el ácido nucleico no se une a una fase sólida durante la etapa de desanimación y/o desulfonaclón de la reacción con bisulfito. La fase sólida es preferentemente un material que comprende vidrio o sílice, con mayor preferencia lana de vidrio, una membrana de vidrio o una partícula de vidrio magnética. Más aun, se describe la utilización de una fase sólida para unir un ácido nucleico durante la etapa de desanimación y/o desulfonación de la reacción con bisulfito y un estuche que contiene un reactivo de bisulfito y una fase sólida.

Los genes constituyen solamente una pequeña proporción del genoma total de los mamíferos, y el control preciso de su expresión en presencia de un impresionante fondo de ácido desoxlrrlbonuclelco (ADN) no codificadora presenta un problema sustancial para su regulación. El ADN no codificador, que contiene ¡ntrones, elementos repetitivos, y elementos que se pueden transponer potencialmente activos, requiere mecanismos eficaces para su sllenclamlento a largo plazo. Los mamíferos parecen aprovechar las posibilidades que ofrece la metilación de las citosinas para proporcionar un mecanismo heredable para alterar las Interacciones ADN-proteína para asistir en tal sllenclamlento. La metilación del ADN es esencial para el desarrollo de los mamíferos; y desempeña una función potencial durante el envejecimiento y el cáncer. La implicación de la metilación en la regulación de la expresión génlca y como una modificación epigenética que marca los genes imprentados se estableció bien. En los mamíferos, la metilación tiene lugar solo en los residuos de citosina y más específicamente solo en los residuos de cltoslna adyacentes a un residuo de guanina, es decir en la secuencia CG. La detección y mapeo de los sitios de metilación del ADN son etapas esenciales para la comprensión de las señales moleculares que Indican si una secuencia dada está metllada.

Esto se logra actualmente mediante el método que se denomina del bisulfito que se describió por Frommer, M., y otros, Proc Nati Acad Sci U S A 89 (1992) 1827-31) para la detección de 5-metllcltoslnas. El método del bisulfito para el mapeo de la 5-metilcitosina utiliza el efecto de que el hidrógeno sulfito sódico reacciona con la cltoslna pero no reacciona o reacciona solo de manera débil con la 5-metilcitosina. La citosina reacciona con el bisulfito para formar una citosina sulfonada que es un producto intermedio de la reacción la cual es propensa a experimentar una desaminación que resulta en un uracilo sulfonado que puede desulfonarse a uracllo bajo condiciones alcalinas. Es de conocimiento general que el uracilo tiene el comportamiento de apareamiento de bases de la timina diferente al de la cltoslna de partida mientras que la 5-metilcitosina tiene el comportamiento de apareamiento de bases de la cltoslna. Esto hace posible la discriminación entre citosinas metiladas o no metiladas mediante por ejemplo la secuenclaclón genómlca con bisulfito (Grigg, G. y Clark, S., Bioessays 16 (1994) 431-6; Grigg, G. W., DNA Seq 6 (1996) 189-98) PCR específica de metilación (MSP) que se describe en la patente de los Estados Unidos 5,786,146.

Existen varios documentos que se dirigen a aspectos específicos de la reacción con bisulfito (Benyajatl, C., y otros, Nucleic Acids Res 8 (1980) 5649-67) que realizan investigaciones generales acerca de la modificación con bisulfito de la 5-metildesoxicitosinay de la desoxicitosina (Olek, A., y otros, Nucleic Acids Res 24 (1996) 5064-6) que describen un método para la secuenciación de bases con bisulfito de manera que el tratamiento con bisulfito y las etapas de PCR subsecuentes se realizan sobre un material que se incrustra en perlas de agarosa. En el método del bisulfito que se describe porClark, S. J., y otros, Nucleic Acids Res 22 (1994) 2990-7, la muestra se desala después de la desaminación.

Raizis, A. M., y otros, Anal Biochem 226 (1995) 161-6 describen un método con bisulfito para el mapeo de la 5- metilcitosina que minimiza la degradación del molde. Ellos Investigan la influencia del pH, temperatura y tiempo de reacción. Investigaciones similares se realizaron por Grunau, C., y otros, Nucleic Acids Res 29 (2001) E65-5 o Warnecke, P. M., y otros, Methods 27 (2002) 101-7. Diferentes componentes adicionales en la mezcla de bisulfito se describen en el documento WO 01/98528 o por Paulin, R., y otros, Nucleic Acids Res 26 (1998) 5009-10. Se describe una etapa con bisulfito adicional después del tratamiento con bisulfito y de la PCR en el documento WO 02/31186. Komiyama, M. y Oshima, S., Tetrahedron Letters 35 (1994) 8185-8188) investigaron la catálisis de la desaminación de la citosina que se induce por bisulfito en oligodesoxirribonucleótldos.

Existen estuches para realizar tratamientos con bisulfito disponibles come reí al mente en Intergen, que se distribuyen Serologicals Corporation, Norcross, GA, Estados Unidos, por ejemplo el estuche de modificación de ADNCpGenome.

Una variación del método de secuenciación genómica con bisulfito se describe por Feil, R., y otros, Nucleic Acids Res 22 (1994) 695-6, de manera que el ADN genómico se une a perlas de vidrio después de la desaminación y el lavado. Después de la elución el ácido nucleico se desulfona. Se conoce que los ácidos nucleicos pueden aislarse mediante la utilización de su comportamiento de unión a superficies de vidrio, por ejemplo la adsorción a gel de sílice o a tierra de dlatomeas, adsorción a partículas magnéticas de vidrio (MGPs) o a partículas de órgano sllanos bajo condiciones caotróplcas. La extracción mediante la utilización de fases sólidas usualmente contiene las etapas de adición de la solución con los ácidos nucleicos a la fase sólida bajo condiciones que permitan la unión de la sustancia de Interés a la fase sólida, la eliminación del resto de la solución de los ácidos nucleicos unidos a la fase sólida y la subsecuente

liberación de los ácidos nucleicos de la fase sólida en un eluato líquido (que algunas veces se denomina elución). El resultado de tal proceso es usualmente una solución que contiene la sustancia de Interés en estado disuelto.

Todos los métodos de la técnica anterior para el tratamiento con bisulfito tienen desventajas. Por lo tanto, el problema a ser resuelto por la presente invención era proporcionar un método que superara las desventajas de los métodos de la industria anterior.

El problema que se discute con anterioridad se soluciona mediante la proporción de un método para la conversión de una basecitosina, preferentemente de bases citosina, en un ácido nucleico a una base uracilo, preferentemente a bases uracilo, de manera que preferentemente las bases 5-metllcltoslna no se convierten significativamente ("reacción con bisulfito" o "tratamiento con bisulfito") de manera que el ácido nucleico no se une a una fase sólida durante la etapa de desaminación de la reacción con bisulfito. Preferentemente la fase sólida es lana de vidrio, una membrana de vidrio o una partícula de vidrio magnética. Más aun, la presente Invención describe usos de una fase sólida en la etapa de desaminación y/o desulfonación de la reacción con bisulfito y estuches que contienen una fase sólida y reactivos para realizar una reacción con bisulfito.

El uso de una fase sólida durante la etapa de desulfonación de la reacción con bisulfito, tiene la ventaja de que el manejo es más sencillo y/o fácilmente susceptible de automatización. Por ejemplo, cuando se utilizan lanas de vidrio para las etapas de desaminación y/o desulfonación, no son necesarias reacciones de precipitación de ADN que consumen mucho tiempo; la separación del ADN unido-libre puede lograrse fácilmente por centrifugación, el volumen muerto de la lana de vidrio es despreciable y por lo tanto las etapas de lavado son muy eficaces. Esto es una ventaja cuando el ADN que se trata con bisulfito se utiliza para PCR donde inhibidores potenciales pueden reducir significativamente la sensibilidad. El método de acuerdo con la invención puede realizarse fácilmente de manera manual y es por lo tanto muy adecuado para laboratorios más pequeños donde los analizadores de rutina no están disponibles. Para laboratorios mayores con un mayor número de muestras, es ventajosa la utilización de una fase sólida que pueda manejarse por los analizadores de rutina, en particular partículas de vidrio magnéticas. En una reacción con bisulfito de rutina se eligen condiciones desnaturalizantes ya que el bisulfito puede reaccionar... [Seguir leyendo]

1. Método para la conversión de una base citosina en un ácido nucleico a una base uracilo, que comprende las etapas de:

a) incubar el ácido nucleico en presencia de iones sulfito de manera que el ácido nucleico se desamina,

b) unir el ácido nucleico desaminado a una fase sólida,

c) lavar opcionalmente el ácido nucleico desaminado unido a la fase sólida,

d) incubar el ácido nucleico unido a la fase sólida desaminado bajo condiciones alcalinas de manera que el ácido nucleico desaminado se desulfona,

e) lavar opcionalmente el ácido nucleico unido a la fase sólida desaminado y desulfonado, y

f) eluir opcionalmente el ácido nucleico desaminado y desulfonado a partir de la fase sólida.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque la fase sólida es un material que comprende sílice o vidrio.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 caracterizado porque la fase sólida es una lana de vidrio o una membrana de vidrio.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 caracterizado porque la fase sólida es una partícula de vidrio magnética.

5. El método de la reivindicación 4 caracterizado porque la partícula de vidrio magnética tiene un diámetro medio entre 0.5 pm y 5 pm.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 caracterizado porque la partícula magnética de vidrio contiene un objeto magnético con un diámetro entre 5 y 500 nm.

7. El método de la reivindicación 6 caracterizado porque la partícula de vidrio magnética contiene un objeto magnético con un diámetro medio de 23 nm.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 7 caracterizado porque la partícula de vidrio magnética se fabrica por el método sol-gel.

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicho método sol-gel comprende las etapas de

a) suspender objetos magnéticos en un sol

b) hidrólisis del sol para cubrir los objetos magnéticos con un gel,

c) secado por aspersión de los objetos magnéticos cubiertos con un gel en un secador por aspersiónde dos boquillas, y

d) sinterización del polvo secado por aspersión para formar un vidrio a partir del gel que cubre losobjetos magnéticos.

10. Uso de una fase sólida en la etapa de desulfonación de una reacción en donde una base citosina en un ácido nucleico se convierte a una base uracilo en presencia de iones bisulfito con la condición de que el ácido nucleico no se une a la fase sólida durante la etapa de desaminación.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la fase sólida es un material que comprende sílice o vidrio.

12. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, en donde la fase sólida es una lana de vidrio o una membrana de vidrio.

13. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11, en donde la fase sólida es una partícula de vidrio magnética

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 9 o la utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 13, en donde la fase sólida contiene poros.

15. El método o la utilización de acuerdo con la reivindicación 14, en donde los ácidos nucleicos se unen a las superficies en dichos poros.

16. Un estuche para realizar una reacción con bisulfito de acuerdo con el método de la reivindicación 1, en donde el estuche contiene una solución que comprende Iones bisulfito y una fase sólida.

17. El estuche de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la fase sólida es un material que comprende sílice o vidrio.

18. El estuche de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde la fase sólida es una lana de vidrio o una membrana de vidrio.

19. El estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 16 a la 18, en donde la fase sólida es una partícula de vidrio magnética.

20. El estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 16 a la 19, en donde la fase sólida contiene poros.

21. El estuche de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el ácido nucleico se une a las superficies en dichos poros.

22. Uso del estuche de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 16 a la 21 para una reacción, en donde una base citosina en un ácido nucleico se convierte a una base uracilo en la presencia de Iones bisulfito.