Proceso para producir dipéptidos.

Una proteína de las siguientes (a) o (b):

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID Nº:

2 a 8;

(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra el 95 % de identidad o superior con la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID Nº: 6 a 8 y que tiene la actividad de sintetizar un dipéptido aminoácido L-aminoácido L; considerando que se excluye una proteína con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID Nº: 1.

Proceso para producir dipéptidos Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una proteína que tiene actividad de síntesis de dipéptidos y a una proteína para la síntesis de dipéptidos, un proceso para producir la proteína que tiene la actividad de síntesis de dipéptidos, un microorganismo o un transformante que produzca una proteína que tenga actividad de síntesis de dipéptidos y un proceso para producir el dipéptido usando dicho microorganismo o transformante.

Están disponibles para la síntesis de péptidos a gran escala métodos de síntesis química (método de fase líquida y método de fase sólida), métodos de síntesis enzimática y métodos de síntesis biológica, que utilizan técnicas de ADN recombinante. En la actualidad, los métodos de síntesis enzimática y los métodos de síntesis biológica se emplean para la síntesis de péptidos de cadena larga de más de 50 restos y los métodos de síntesis química y los métodos de síntesis enzimática se emplean principalmente para la síntesis de dipéptidos.

Sin embargo, en la síntesis de dipéptidos mediante los métodos de síntesis química son necesarias operaciones, tales como la introducción y la eliminación de grupos protectores para grupos funcionales, y también se forman racematos. Por lo tanto, se considera que los métodos de síntesis química presentan desventajas con respecto al coste y a la eficacia. También son poco favorables desde el punto de vista de la higiene medioambiental, debido al uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos y similares.

En cuanto a la síntesis de dipéptidos mediante los métodos enzimáticos, se conocen los siguientes métodos: un método que utiliza una reacción inversa de la proteasa (J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)); métodos que utilizan una aminoacil-ARN-t sintetasa termoestable (Solicitud de patente japonesa publicada no examinada N° 146539/83, Solicitud de patente japonesa publicada no examinada N° 209991/83, Solicitud de patente japonesa publicada no examinada N° 209992/83 y Solicitud de patente japonesa publicada no examinada N° 106298/84); y métodos que utilizan una péptido sintetasa no ribosómica (en lo sucesivo denominada como NRPS) (Chem. Biol., 7, 373-384 (2000); FEBS Lett, 498, 42-45 (2001); Patente de Estados Unidos N° 5.795.738 y Patente de Estados Unidos N° 5.652.116).

No obstante, el método que utiliza una reacción inversa de la proteasa requiere la introducción y la eliminación de grupos protectores para grupos funcionales de los aminoácidos que se usan como sustratos, lo que causa dificultades en el aumento de la eficacia de la reacción de formación de péptidos y en la presentación de la reacción de degradación de péptidos. Los métodos que utilizan aminoacil-ARN-t sintetasa termoestable tienen el defecto de que es difícil la expresión de la enzima y la prevención de reacciones secundarias que formen subproductos aparte de los productos deseados. Los métodos que utilizan NRPS son ineficaces por el hecho de que la expresión de la enzima mediante técnicas de ADN recombinante es difícil debido al gran tamaño molecular de la enzima y a que es necesario el suministro de la coenzima 4-fosfopanteteína.

Por otro lado, existen un grupo de péptido sintetasas que tienen un peso molecular de enzima inferior al de NRPS y que no requieren coenzima 4-fosfopanteteína; por ejemplo, y-glutamilcisteína sintetasa, glutatión sintetasa, D-alanina-D-alanina (D-Ala-D-Ala) ligasa y poli-y-glutamato sintetasa. La mayoría de estas enzimas utilizan aminoácidos D como sustratos o catalizan la formación de enlaces peptídicos en el grupo y-carboxilo. Debido a dichas propiedades, no pueden usarse para la síntesis de dipéptidos mediante la formación de enlaces peptídicos en el grupo a-carboxilo de aminoácidos L.

El único ejemplo conocido de una enzima capaz de la síntesis de dipéptidos mediante la actividad de formación de un enlace peptídico en el grupo a-carboxilo de un aminoácido L es la bacilisina (antibiótico dipeptídico procedente de un microorganismo que pertenece al género Bacillus) sintetasa. Se sabe que la bacilisina sintetasa tiene la actividad de sintetizar bacilisina [L-alanil-L-anticapsina (L-Ala-L-anticapsina)] y L-alanil-L-alanina (L-Ala-L-Ala) pero no existe información acerca de su actividad de síntesis de otros péptidos (J. Ind. Microbiol., 2, 201-208 (1987) y Enzyme. Microbial. Technol., 29, 400-406 (2001)).

En cuanto a los genes de la bacilisina biosintetasa en Bacillus subtilis 168. cuya información genómica completa se ha clarificado (Nature, 390, 249-256 (1997)), se sabe que la productividad de la bacilisina se aumenta mediante la amplificación de operones de bacilisina que contienen las ORF ywfA-F (folleto WO00/03009). Sin embargo, no se sabe si estas ORF contienen una ORF que codifica una proteína que tiene la actividad de ligar dos o más aminoácidos mediante un enlace peptídico, y si la contienen, qué ORF codifica la proteína.

Además, la entrada de la base de datos UNIPROT P39461 describe proteínas no determinadas de Bacillus subtilis cuya función no está descrita. Además, el documento WO 00/03009 describe que una enzima parcialmente purificada preparada a partir de Bacillus subtilis Py79 cataliza el intercambio de ATP-PPi, pero no describe la secuencia de aminoácidos de la enzima. Yazgan et al., Enzyme and Microbial Technology, 29, 400-406 (2001)

divulga el conjunto de genes necesarios para la síntesis de bacilisina, pero no divulga si este conjunto de genes codifica, en efecto, los polipéptidos, produciendo dipéptidos.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una proteína que tiene la actividad de sintetizar un dipéptido que es distinto de L-Ala-L-Ala, y para el que no se ha propuesto hasta ahora ningún método de síntesis enzimática usando una péptido sintetasa o similar, y una proteína para la síntesis del dipéptido; ADN que codifica la proteína que tiene la actividad de síntesis de dipéptidos; un ADN recombinante que comprende el ADN; un transformante que lleva el ADN recombinante; un proceso para producir la proteína que tiene la actividad de síntesis de dipéptidos; También se describe en este documento un método enzimático para la síntesis del dipéptido que usa la proteína que tiene una actividad de síntesis de dipéptidos o la proteína de una síntesis de dipéptidos; y un proceso para producir el uso de dipéptido, como una fuente enzimática, un cultivo de un microorganismo que tiene la capacidad de producir una proteína que tiene la actividad de síntesis de dipéptidos o una proteína para la síntesis de dipéptidos o similares, como se describe en este documento.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a los siguientes, del (1) al (9).

(1) Una proteína de los siguientes (a) o (b):

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID N°: 2 a 8;

(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra una similitud del 95 % o superior con la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID N°: 6 a 8 y que tiene la actividad sintetizar un dipéptido de Aminoácido L- aminoácido L; considerando que se excluye una proteína que consiste en la SEC ID N°: 1.

(2) Un ADN seleccionado del grupo constituido por:

(a) un ADN que codifica la proteína de acuerdo con [1];

(b) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID N°: 10 a

16 y 36; y

(c) un ADN que híbrida con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID N°: 9 a 16 y 36 en condiciones rigurosas y que codifica una proteína que tiene la actividad para sintetizar un dipéptido de aminoácido L- Aminoácido L:

considerando que se excluye el ADN constituido por en la secuencia de nucleótidos que muestra en SEC ID N°:9.

(3) Un ADN recombinante que comprende el ADN de acuerdo con [2].

(4) Un transformante que lleva el ADN recombinante de acuerdo con [3].

(5) El transformante de acuerdo con [4], donde el transformante es un transformante obtenido usando un microorganismo como un hospedador.

(6) El transformante de acuerdo con [5], donde el microorganismo es un microorganismo que pertenece al género Escherichia.

(7) Un proceso para producir la proteína de acuerdo con [1], que comprende cultivar el transformante de acuerdo con cualquiera de [4] a [6] en un medio, permitiendo que la proteína de acuerdo con la reivindicación 1 se forme y se acumule en un cultivo y que se recupere la proteína del cultivo.

(8) Un proceso para producir la proteína de acuerdo con [1],... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de las siguientes (a) o (b):

(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID N°: 2

a 8;

(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra el 95 % de identidad o superior con la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID N°: 6 a 8 y que tiene la actividad de sintetizar un dipéptido aminoácido L-aminoácido L; considerando que se excluye una proteína con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID N°: 1.

2. Un ADN seleccionado entre grupo constituido por:

(a) un ADN que codifica la proteína de acuerdo con la reivindicación 1;

(b) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEC ID N°: 10 a 16 y 36; y

(c) un ADN que híbrida con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID N°: 9 a 16 y 36 en condiciones rigurosas y que codifica una proteína que tiene la actividad para sintetizar un dipéptido aminoácido L- aminoácido L;

considerando que se excluye el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEC ID

N°:9.

3. Un ADN recombinante que comprende al ADN de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Un transformante que lleva el ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3.

5. El transformante de acuerdo con la reivindicación 4, donde el transformante es un transformante obtenido usando un microorganismo como un hospedador.

6. El transformante de acuerdo con la reivindicación 5, donde el microorganismo es un microorganismo que pertenece al género Escherichia.

7. Un proceso para producir la proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende cultivar el transformante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en un medio, permitiendo que se forme la proteína de acuerdo con la reivindicación 1 y se acumule en un cultivo y que se recupere la proteína del cultivo.

8. Un proceso para producir la proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende cultivar un microorganismo que tiene la capacidad de producir la proteína de acuerdo con la reivindicación 1 en un medio, permitiendo que se forme la proteína y se acumule en un cultivo y que se recupere la proteína del cultivo.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, donde el microorganismo es un microorganismo que pertenece al género Bacillus.

10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, donde el microorganismo que pertenece al género Bacillus es un microorganismo que pertenece a una especie seleccionada del grupo constituido por Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium y Bacillus pumilus.