Genes con expresión específica de células ES.

Uso de una sonda que comprende un ADN del tipo (a) o (b) siguiente:



(a) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 4 o 15;

(b) un ADN que se hibrida con el ADN de (a) en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína expre- sada específicamente en una célula ES,

para determinar si una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano es una célula ES.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2002/005350.

Solicitante: Yamanaka, Shinya.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 2-9-7-1401, Dougashiba, Tennoji-ku Osaka-shi Osaka 543-0033 JAPON.

Inventor/es: YAMANAKA,Shinya, KAIHO,EIKO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/09 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2544854_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Genes con expresión específica de células ES

La presente Invención se refiere al uso de un gen ECAT (gen transcrito asociado a células ES) expresado específicamente en células ES (células madre embrionarias).

Técnica anterior

Una célula madre embrionaria (ES, del Inglés "embryonic stem") es una célula aislada a partir de un embrión temprano de mamífero, que continúa proliferando de forma semipermanente, aunque conserva la capacidad de diferenciarse en cualquier célula en el cuerpo, es decir, la pluripotencia. Las células ES se establecieron por primera vez en ratón en 1981, y aportaron una técnica trascendental para el análisis de la función gènica utilizando ratones con genes desactivados. Aunque el establecimiento de las células ES humanas ya se describió en 1998, su aplicación en la medicina regenerativa ha sido muy esperada. Un intento es lograr una recuperación funcional mediante el trasplante de células musculares cardiacas o células nerviosas diferenciadas procedentes de células ES, en pacientes con Infarto de corazón y enfermedades neurodegenerativas.

Aunque la terapia de trasplante de células ya se ha empleado, como se observa típicamente en el Injerto de médula en la leucemia, está asociada con dos problemas, garantizar un suministro suficiente de células que se van a trasplantar e Inhibir una reacción de rechazo. El uso de las células ES que se dividen de forma semlpermanente, resuelve totalmente el problema de un suministro garantizado de una cantidad suficiente de células. Cuando se combina con la tecnología de clonación de células somáticas, por otra parte, la reacción de rechazo también se puede superar. Cuando se establece una célula ES a partir de un embrión clonado, preparado a partir de una célula somática de un paciente y se utiliza para trasplante, el rechazo no puede ocurrir ya que tiene el mismo gen que el paciente. Por lo tanto, las células ES tienen el potencial de resolver simultáneamente los dos problemas de la terapia de trasplante de células.

Aunque las células ES tienen un potencial elevado tal y como se ha descrito anteriormente, las células ES humanas son difíciles de establecer y mantener, en comparación con las células ES de ratón. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de una técnica de establecimiento y una técnica de cultivo fiables. Además, para que se establezca una célula ES humana, se tiene que sacrificar un embrión. Cuando se combina con la tecnología de clonación de células somáticas, conduce fácilmente a la clonación humana. Por lo tanto, para resolver este tipo de cuestiones éticas, se desea el desarrollo de una técnica para producir directamente una célula similar a ES que tenga pluripotencia, a partir de una célula somática, sin tener que pasar por un embrión.

Lo que desempeña un papel clave en el desarrollo de estas técnicas es un gen (gen transcrito asociado a células ES, en lo sucesivo, gen ECAT), que se expresa específicamente en las células plurlpotenclales tales como células ES y similares. El gen ECAT se convierte en un marcador para determinar si la célula es una célula ES. Además, las células ES se pueden seleccionar de manera eficaz a partir de un cultivo mixto de diversos tipos de células, mediante la combinación de una región de control del gen ECAT que induce la expresión específica de células ES y un gen de resistencia a los fármacos (documento JP-T-9-500004; correspondiente a la patente de Estados Unidos n° 6146888). Además, puede ser posible favorecer la conversión de una célula somática a una célula similar a ES mediante la Inducción de la expresión de un gen ECAT.

El único gen descrito hasta la fecha como un gen ECAT es el gen del factor de transcripción Oct3 (también denominado Oct4, POU5f1, en lo sucesivo, se denominará Oct-3/4). Aunque se ha descrito un gen similar con respecto a los seres humanos (en lo sucesivo, denominado gen hOct-3/4: Takeda et al., Nucleic Acids Res. 20: 4613-4620, 1992, SEQ ID NO: 39), no se ha encontrado hasta ahora ninguna reseña sobre una expresión específica verificada en células ES del gen hOct-3/4. Oct-3/4 es un factor de transcripción que se expresa específicamente en una célula ES y una célula EG (células germinales embrionarias), cuya expresión desaparece junto con la diferenciación celular. Por lo tanto, se utiliza como un marcador de células ES, y se ha intentado el establecimiento eficaz de células ES mediante el Intercambio de un gen por uno de resistencia a neomicina en su locus gènico (documento JP-T-9- 500004; correspondiente a la Patente de Estados Unidos n° 6146888). Sin embargo, también se ha documentado en un Informe que Oct-3/4 se expresa también en las células del trofodermo, además de las células pluripotenciales (Blol Reprod 63: 1698-1705, 2000). Por lo tanto, el uso del gen Oct-3/4 solo como indicador, produce como resultado la selección de células distintas a las células ES. Para evitar este riesgo, es deseable identificar varios genes ECAT y usarlos de forma combinada.

Incluso si se Induce la expresión solo de Oct-3/4 en células somáticas, no se observa la conversión a células similares a ES. Incluso si Oct-3/4 se expresa constantemente, la diferenciación de las células ES (diferenciación en endoderma primitivo, ectodermo primitivo) asociada con la retirada de LIF (factor inhibidor de la leucemia) no se puede Inhibir. Por el contrario, se ha publicado un Informe interesante en el que al aumentar la cantidad de expresión de Oct-3/4 solo aproximadamente 1,5 veces el nivel general, se induce una diferenciación similar a la asociada con la retirada de LIF (Experimental Medicine, 19, 330-338, 2001). Como se ha descrito anteriormente, la acción de Oct-3/4 no es simple y la inducción del mismo en células ES mediante la expresión de Oct-3/4 solo en células somáticas, es difícil. Desde este aspecto, también, se considera necesario combinar varios genes ECAT y analizar las células ES.

Sin embargo, no se han encontrado genes ECAT distintos del gen Oct-3/4 y existe un gran requerimiento de que se proporcione un nuevo gen ECAT, desde los aspectos de la medicina regenerativa y la aplicación de células ES al trasplante de células.

Descripción de ia invención

La presente invención tiene por objeto proporcionar un método de escrutinio de células ES utilizando un gen ECAT y un péptido de un producto génlco codificado por el mismo.

Para identificar genes ECAT candidatos, los presentes inventores utilizaron la base de datos EST (marcador de secuencia expresada) (detalle que se describirá posteriormente) para el análisis informático, e identificaron genes candidatos hasta llegara 10 genes. De los 10 genes, 8 genes se sometieron a transferencia Northern, mediante la cual se analizó la expresión en células ES y 12 tipos de órganos (ratón). Como resultado, se encontró que la expresión de los 8 genes era específica de las células ES. También se encontró que la expresión de estos genes desaparecía rápidamente después de la estimulación de las células ES con ácido retinolco, es decir, mediante Inducción de la diferenciación. Basándose en los resultados anteriores, los presentes Inventores han encontrado que estos 8 genes son genes ECAT, lo que ha dado como resultado la realización de la presente invención. De los dos genes restantes, un gen se analizó por transferencia Northern y técnicas similares, y se encontró que el gen era un gen ECAT.

Además, se ha Identificado un gen humano homólogo al gen ECAT (en lo sucesivo, hECAT) y se ha analizado la expresión en células ES y 13 tipos de órganos (humanos).

Por consiguiente, la presente Invención proporciona lo siguiente.

(1) Uso de una sonda que comprende un ADN del tipo (a) o (b) siguiente:

(a) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 4 o 15;

(b) un ADN que se híbrida con el ADN de (a) en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína expresada específicamente en una célula ES,

para determinar si una célula, que no se ha obtenido a partir de un embrión humano, es una célula ES.

(2) Uso de una sonda que comprende un ADN del tipo (a) o (b) siguiente:

(a) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 31;

(b) un ADN que se híbrida con el ADN de (a) en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína expresada específicamente en una célula ES,

para determinar si una célula, que no se ha obtenido a partir de un embrión humano, es una célula ES.

(3) Un método para escrutar una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano para determinar si es una célula ES, que comprende analizar un estado de expresión intracelular de un ADN que tiene una secuencia... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Uso de una sonda que comprende un ADN del tipo (a) o (b) siguiente:

(a) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 4 o 15;

(b) un ADN que se híbrida con el ADN de (a) en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína expresada específicamente en una célula ES,

para determinar si una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano es una célula ES.

2. Uso de una sonda que comprende un ADN del tipo (a) o (b) siguiente:

(a) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 31;

(b) un ADN que se híbrida con el ADN de (a) en condiciones rigurosas y que codifica una proteína expresada específicamente en una célula ES,

para determinar si una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano es una célula ES.

3. Un método para escrutar una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano para determinar si es una célula ES, que comprende analizar un estado de expresión intracelular de un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 15 o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 16.

4. El método según la reivindicación 3, que comprende adicionalmente analizar un estado de expresión intra- celular de un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 11o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 12.

5. El método según la reivindicación 3 o 4, que comprende adicionalmente analizar un estado de expresión intracelular de un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 25 o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 26.

6. Un método para escrutar una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano para determinar si es una célula ES, que comprende analizar un estado de expresión intracelular de un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 31 o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 32.

7. El método según la reivindicación 6, que comprende adicionalmente analizar un estado de expresión intracelular de un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 39 o una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 40.

8. Uso de una sonda que comprende un ADN que no tiene menos de 20 bases continuas procedentes de una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 15, en donde el ADN no tiene una secuencia repetitiva, para determinar si una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano es una célula ES.

9. Uso de una sonda que comprende un ADN que no tiene menos de 20 bases continuas procedentes de una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 31, en donde el ADN no tiene una secuencia repetitiva, para determinar si una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano es una célula ES.

10. Un método para escrutar una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano para determinar si es una célula ES, que comprende analizar un estado de expresión de un gen expresado específicamente en una célula ES, empleando la sonda definida en la reivindicación 1 u 8.

11. Un método para escrutar una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano para determinar si es una célula ES, que comprende analizar un estado de expresión de un gen expresado específicamente en una célula ES, empleando la sonda definida en la reivindicación 2 o 9.

12. El método según la reivindicación 10, que comprende adicionalmente emplear una sonda para seleccionar células ES que comprende un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 2 u 11.

13. El método según la reivindicación 10 o 12, que comprende adicionalmente emplear una sonda para seleccionar células ES que comprende un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 25.

14. El método según la reivindicación 11, que comprende adicionalmente emplear una sonda para seleccionar células ES que comprende un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 27.

15. El método según la reivindicación 11 o 14, que comprende adicionalmente emplear una sonda para seleccionar células ES que comprende un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 39.

16. El uso de un anticuerpo para determinar si una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano es una célula ES, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteina del tipo (a) o (b) siguiente:

(a) una proteina que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 16;

(b) una proteina que tiene una secuencia de aminoácidos de (a) en donde se deleclonan, sustituyen o adl-

5 clonan uno a varios aminoácidos, y que se expresa específicamente en una célula ES.

17. El uso de un anticuerpo para determinar si una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano es una célula ES, en donde el anticuerpo se une específicamente a una proteina del tipo (a) o (b) siguiente:

(a) una proteina que tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 32;

(b) una proteina que tiene una secuencia de aminoácidos de (a) en donde se deleclonan, sustituyen o adl-

10 clonan uno a varios aminoácidos, y que se expresa específicamente en una célula ES.


 

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