Cepas de Agrobacterium desarmadas, plásmidos Ri y procedimientos de transformación basados en ellas.

Un procedimiento para producir una célula de planta transgénica que comprende las etapas de:

a) proporcionar bacterias de una variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de Agrobacterium (NCPPB 2659) que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra caracterizada por una secuencia intergénica de ARNr 16S-23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de secuencia descritos por SEC ID Nº: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que dicha variante de cepa comprende además una variante de plásmido no patógeno del plásmido Ri pRi2659 y un ADN-T transgénico, y

b) co-cultivar una célula de planta con dichas bacterias, y

c) aislar o seleccionar células vegetales que comprenden establemente integrado en su genoma dicho ADN-T transgénico,

en el que dicha variante de cepa no patógena es capaz de infectar células vegetales, para mediar en la transferencia de ADN-T en células vegetales, y para mediar en la inserción de ADN-T en el genoma de la planta, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y

en el que la variante de plásmido no patógeno comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia como se describe por SEC ID Nº: 24.

de ¡os dibujos

Fig. 1A Dendrograma que demuestra la relación de cepas de Agroóacfer/a como se ha determinado por RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar) (Figura 2 de Llob 2003). Para la descripción de las diversas cepas véase la Tabla 1 a continuación. La cepa K599 de Agroóacfenum (NCPPB 2659) bajo estas condiciones se agrupa en un grupo distinto de cultivares separado de las cepas de "Agroóacfer/um fume/ac/ens" tradicionales tales como C58 o Ach5, pero también de otras cepas de "Agroóacfenum r/r/zogenes "tales como NCPPB 8196 o ATCC 15834.

Fig. 1B Dendrograma que demuestra la relación de cepas de Agroóacfer/am como se ha determinado por comparación de ARNr 16S. Las secuencias se compilan usado el programa Clustal W(Saitou 1987). Las cepas se describen por el n° de acceso de GenBank de sus ARNr 16S respectivos. Se evalúan las siguientes cepas:

(continuación)

Fig. 1C Dendrograma que demuestra la relación de cepas de /tgroóacfer/trm como se ha determinado por la comparación de secuencias de aminoácidos de virD2. Las secuencias se compilan usando el programa Clustal W 5 (Saitou 1987). Las cepas se describen por el n° de acceso de GenBank de sus proteínas virD2 respectivas. Se evalúan las siguientes cepas:

Fig. 2: Mapa de restricción física de la región de ADN-T del plásmido pR¡2659 de Agroóacfer/trm. Las flechas

indican las regiones de límite derecho e izquierdo (de: Combard 1987).

10 Fig. 3 Expresión transitoria de GUS en soja (5 días) de explantes de meristemos axilares de hojas después de 2 días de co-cultivo con tanto AGL1 (pBPSMM192b) (I) como SHA016 (pBPSMM192b) (II). SHA016/pBPSMM192b es

una cepa de variante de K599 de /Sgv-oóacfen'um transgénica desarmada. AGL1/pBPSMM192b es una cepa de control. Las cepas SHA001 y SHA016 de Agroóacfen'um son cepas funcionalmente equivalentes de la cepa K599 de Agroóacfer/um (NCPPB 2659) (pR¡2659Atet), es decir, que comprenden el plásmido pR¡2659Atet desarmado.

Fig. 4 Expresión estable de GUS en soja 35 días después de la infección usando explantes de merlstemos axilares de hojas infectadas con SHA001 de Agrobacfer/um (pBPSEW008) (I, II, III: ejemplos para diversos explantes). SHA001 (pBPSEW008) es una cepa de variante de K599 de Agroóacfer/u/7? transgénica desarmada (pRI2659Atet).

Fig. 5 Plántulas de tomate transgénlcas (A) usando SFIA001 recombinante que contiene pBPSMM192b y expresión de GUS en las hojas transgénlcas (B). SFIA001 (pBPSMM192b) es una cepa de variante de K599 de Agroóacfen'um transgénica desarmada (pRI2659Atet).

Fig. 6 Fllbrldación Southern de K599 marcada con tetraciclina desarmada (pR¡2659Atet). La pérdida de una banda de hibridación en eventos de doble cruce, cuando se sonda con límite derecho, Indica la deleclón de la reglón de ADN-T de pR¡2659 (Southern Inferior). La banda de hibridación en Southern superior Indica la presencia de ADN flanqueante fuera de la deleclón de ADN-T.

FD = hibridación con sonda del flanco derecho Fl = hibridación con sonda del flanco Izquierdo WT = no mutante

1. Un procedimiento para producir una célula de planta transgénica que comprende las etapas de:

a) proporcionar bacterias de una variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de /tgroóacfer/u/n (NCPPB 2659) que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra caracterizada por una secuencia ¡ntergénlca de ARNr 16S-23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de secuencia descritos porSEC ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que dicha variante de cepa comprende además una variante de plásmido no patógeno del plásmido R¡ pR¡2659 y un ADN-T transgénico, y

b) co-cultlvar una célula de planta con dichas bacterias, y

c) aislar o seleccionar células vegetales que comprenden establemente integrado en su genoma dicho ADN-T transgénico,

en el que dicha variante de cepa no patógena es capaz de infectar células vegetales, para mediar en la transferencia de ADN-T en células vegetales, y para mediar en la inserción de ADN-T en el genoma de la planta, pero carece de propiedades Inductoras del fenotipo de raíces pilosas y

en el que la variante de plásmido no patógeno comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia como se describe por SEC ID N°: 24.

2. Un procedimiento para producir una planta transgénica que comprende las etapas de:

a) proporcionar bacterias de una variante de cepa no patógena, transgénica de la cepa K599 de Agroóacfenum (NCPPB 2659) que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra, caracterizada por una secuencia ¡ntergénlca de ARNr 16S-23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de secuencia descritos porSEC ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en el que dicha variante de cepa es capaz de infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y en el que dicha vahante de cepa comprende además una variante de plásmido no patógeno del plásmido R¡ pR¡2659 y un ADN-T transgénico, y

b) co-cult¡var una planta, célula de planta o tejido de planta con dichas bacterias, y

c) aislar o seleccionar y, opcionalmente, regenerar plantas que comprenden establemente integrado en su genoma dicho ADN-T transgénico,

en el que dicha variante de cepa no patógena es capaz de infectar células vegetales, para mediar en la transferencia de ADN-T en células vegetales, y para mediar en la inserción de ADN-T en el genoma de la planta, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas y

en el que la variante de plásmido no patógeno comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia como se describe porSEC ID N°: 24.

3. El procedimiento de cualquiera de la reivindicación 1 o 2, en el que dicha célula de planta, tejido de planta o planta se deriva de una planta seleccionada del grupo de plantas monocotiledóneas, plantas dicotiledóneas y plantas gimnospermas.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha planta es de un género seleccionado del grupo que consiste en Med/cago, Lycopers/co/i, Brass/ca, Cucum/s, So/anam, Jag/ans, Gossyp/um, Ma/us, Mf/s, Anf/rrh/nam, Popa/as, Fragar/a, Araó/dops/s, P/cea, Caps/cam, Chenopod/am, Dendranfdema, Pharó/f/s, Pinas, P/sam, O/yza, Zea, Tr/f/cam, Tn'f/ca/e, Seca/e, Lo/zarn, Pordeam, G/yc/ne, Pseadofsaga, Ka/anchoe, Befa, Pe/ianfhas y Mcof/ana.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho ADN-T transgénico comprende al menos un gen marcador de selección expresable en planta.

6. Una variante de plásmido no patógeno de pR¡2659, proporcionando dicha variante de plásmido las funciones requeridas para la infección y transformación de la célula de planta y que tiene una homología de al menos el 90 % con el ADN que codifica el plásmido pR¡2659 nativo (como está comprendido en la cepa K599 de Agroóacfedum (NCPPB2659)), pero que carece de secuencias que provocan el fenotipo de raíces pilosas, y en la que el ADN-T entero correspondiente a la secuencia descrita por la secuencia de aproximadamente la base 538 a aproximadamente la base 15.519 de SEC ID N°: 4, que incluye los límites, está delecionado y el ADN-T delecionado.

7. Una célula u organismo no humano que comprende una vahante de plásmido no patógeno de la reivindicación 6.

8. La célula u organismo no humano de la reivindicación 7, en el que dicha célula u organismo está seleccionado del grupo que consiste en bacterias, levaduras, plantas, mamíferos e insectos.

9. La célula u organismo no humano de la reivindicación 7 u 8, en el que dicha célula u organismo es una bacteria transmitida por la tierra del género Ph/zoó/aceae.

10. Una variante de cepa no patógena de la cepa K599 de Agrobacfenum (NCPPB 2659), que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra, caracterizada por una secuencia intergénica de ARNr 16S-23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de secuencia descritos por SEC ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en la que dicha variante de cepa es capaz de infectar

5 células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas, que comprende una variante de plásmido no patógeno del plásmido R¡ pR¡2659, que comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia como se describe por SEC ID N°: 24.

11. Una variante de cepa no patógena transgénica de la cepa K599 de Agrobacfe/ftvm (NCPPB 2659), que es una bacteria patógena de las plantas transmitida por la tierra, caracterizada por una secuencia intergénica de ARNr 16S-

10 23S que comprende al menos un motivo de secuencia seleccionado del grupo que consiste en los motivos de

secuencia descritos por SEC ID N°: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, en la que dicha variante de cepa es capaz de Infectar células vegetales, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas, y en la que dicha vahante de cepa comprende además una variante de plásmido no patógeno del plásmido R¡ pR¡2659 que comprende al menos una secuencia que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90 % con una secuencia

15 como se describe por SEC ID N°: 24 y que comprende un ADN-T transgénico.

12. La variante de cepa no patógena de cualquiera de la reivindicación 10 u 11, en la que dicha variante de cepa no patógena es capaz de infectar células vegetales, para mediar en la transferencia de ADN-T en células vegetales, y para mediar en la inserción de ADN-T en el genoma de la planta, pero carece de propiedades inductoras del fenotipo de raíces pilosas.

20 13. La variante de cepa no patógena de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que la variante de plásmido

no patógeno se define como en la reivindicación 6.

14. La vahante de cepa no patógena de cualquiera de las reivindicaciones 10 o 13, que comprende además una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la presencia de genes v/rA o v/rG mutantes o quiméricos o la presencia de plásmidos super-virulentos.