Identificación de antígenos asociados a superficies para el diagnóstico y la terapia de tumores.

Método para el diagnóstico o el control de una enfermedad cancerosa que se caracteriza porque se sobreexpresa un antígeno asociado a tumor en un tejido tumoral,

en comparación con un tejido sano comparable, y el método comprende

(i) la detección de un ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a tumor, y/o

(ii) la detección del antígeno asociado a tumor

en una muestra biológica aislada de un paciente,

en cuyo caso el antígeno asociado a tumor presenta una secuencia que es codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 13 del protocolo de secuencias, y la enfermedad cancerosa es un carcinoma en el área de cabeza-cuello o una leucemia.

Identificación de antígenos asociados a superficies para el diagnóstico y la terapia de tumores

A pesar de los planteamientos interdisciplinarios y el uso exhaustivo de modalidades terapéuticas, las enfermedades cancerosas siguen perteneciendo a las causas principales de muerte. Los nuevos conceptos terapéuticos apuntan a influir el sistema inmune propio del paciente en el concepto terapéutico general usando vacunas de tumor 5 recombinantes y otras medidas específicas como terapias de anticuerpos. Un prerrequisito para el éxito de una estrategia tal es el reconocimiento de antígenos o epítopos específicos de un tumor o asociados a un tumor por el sistema inmune del paciente, cuyas funciones efectoras deben intensificarse mediante intervención. Las células tumorales difieren biológicamente, de manera sustancial, de sus células no malignas de origen. Estas diferencias se deben a modificaciones genéticas adquiridas durante el desarrollo del tumor y también dan lugar, entre otras, a la 10 formación de estructuras moleculares, modificadas cualitativa o cuantitativamente en las células cancerosas. Si tales estructuras asociadas con un tumor son reconocidas por el sistema inmune específico del hospedero que porta el tumor, se habla de antígenos asociados a tumor.

En el reconocimiento específico de antígenos asociados a tumor se involucran mecanismos celulares y humorales, los cuales representan dos unidades funcionalmente interconectadas: linfocitos T CD4+ y CD8+ reconocen antígenos 15 procesados que existen en las moléculas del MHC (Major Histocompatibility complex o complejo principal de histocompatibilidad = antígenos de histocompatibilidad) clases II y I, respectivamente, mientras que los linfocitos B producen moléculas de anticuerpo circulantes, las cuales se enlazan directamente con antígenos no procesados.

El significado clínico-terapéutico potencial de los antígenos asociados a tumor resulta del hecho que el reconocimiento de antígenos en células neoplásicas por el sistema inmune conduce a la iniciación de mecanismos 20 efectores citotóxicos, y en presencia de células auxiliares T puede causar la eliminación de las células cancerosas (Pardoll, Nat. Med. 4:525-31, 1998) . Por consiguiente, un objetivo central de la inmunología de tumor es definir molecularmente estas estructuras. La naturaleza molecular de estos antígenos ha sido enigmática por mucho tiempo. Solamente después de desarrollar técnicas de clonación correspondientes ha sido posible cribar librerías de expresión de ADNc de tumores de manera sistemática para antígenos asociados a tumor analizando las estructuras 25 diana de linfocitos T citotóxicos (CTL) (van der Bruggen et al., Science 254:1643-7, 1991) usando autoanticuerpos circulantes (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. 9:709-16, 1997) en calidad de sondas. Para este propósito se prepararon librerías de expresión de ADNc a partir de tejido fresco de tumor y se expresaron de manera recombinante como proteínas en sistemas adecuados. Immunoefectores aislados de pacientes, más precisamente clones de CTL con patrones de lisis específicos para tumor, autoanticuerpos circulantes se utilizaron para clonar los 30 antígenos respectivos.

Por medio de estos planteamientos, en los últimos años se ha definido una gran cantidad de antígenos en diferentes neoplasias. La clase de los antígenos de testículo/cáncer (CTA) . CTA y los genes que los codifican (genes de testículo/cáncer o CTG) se definen por su patrón de expresión característico (Türeci et aI., Mol. Med. Today 3:342-9. 1997) . Éstos no se encuentran en tejidos normales, excepto testículos y células germinales, pero se expresan en un 35 número de malignomas humanos de modo no específico para el tipo de tumor sino con diferente frecuencia en entidades tumorales de orígenes muy diferentes (Chen & Old, Cancer J. Sci. Am. 5:16-7. 1999) . Las actividades de suero contra CTA tampoco se encuentran en controles sanos sino sólo en pacientes con tumor. Esta clase de antígenos, principalmente debido a su distribución de tejido, es particularmente valiosa para proyectos inmunoterapéuticos y se ensaya en estudios clínicos actuales sobre pacientes (Marchand et aI., Int. J. Cancer 40 80:219-30, 1999; Knuth et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46: pp. 46-51, 2000) .

Sin embargo, para la identificación de antígenos, los procedimientos clásicos presentados antes utilizan inmunoefectores (autoanticuerpos circulantes o clones CTL) de pacientes regularmente con cáncer ya avanzado en calidad de sondas. De una serie de datos se desprende que los tumores, por ejemplo para la inducción de tolerancia y de anergia de células T y que durante el transcurso de la enfermedad se pierden del repertorio inmunoefector, 45 pierden aquellas especificidades que pueden provocar un inmunorreconocimiento efectivo. Los estudios actuales en pacientes aún no han producido una evidencia sólida de acción real de los antígenos asociados a tumor previamente encontrados y utilizados. Por consiguiente, no puede excluirse que las proteínas que evocan respuestas inmunes espontáneas son estructuras diana equivocadas.

El objetivo de la presente invención fue proporcionar estructuras diana para diagnóstico y terapia de enfermedades 50 cancerosas.

Este objetivo se logra de acuerdo con la invención por medio del objeto de las reivindicaciones.

De acuerdo con la invención, se persiguió una estrategia para identificar y proporcionar antígenos expresados en asociación con un tumor y los ácidos nucleicos que los codifican. Esta estrategia se basa en evaluar bases de datos de proteína y ácidos nucleicos humanos con respecto a antígenos potenciales, específicos del cáncer, que son 55

accesibles sobre la superficie celular. La definición de los criterios de filtro necesarios para esto, junto con una metodología de alto rendimiento para analizar todas las proteínas, si es posible, forman la parte central de la invención. Por medio de la minería de datos primeros se produce una lista, tan completa como sea posible, de todos los genes conocidos que se examinan de acuerdo con el principio básico "gen a ARNm a proteína" para establecer la presencia de uno o más dominios transmembrana. Esto es seguido por una búsqueda de homología, una 5 clasificación de los aciertos en grupos específicos de tejido (entre otros, tejidos tumorales) y una inspección de la existencia real del ARNm. Finalmente, las proteínas que se identifican de esta manera se evalúan en su activación aberrante en tumores, por ejemplo mediante análisis de expresión y procedimientos químicos de proteína.

La minería de datos es un método conocido para identificar genes asociados a tumor. En las estrategias convencionales, sin embargo, usualmente se sustraen electrónicamente los transcriptomas de las librerías de tejidos 10 tumorales suponiendo que los genes que permanecen son específicos de tumor (Schmitt et al., Nucleic Aeids Res. 27:4251-60, 1999; Vasmatzis et aI., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:300-4, 1998; Scheurle et al., Cancer Res. 60:4037-43, 2000) .

El concepto de acuerdo con la invención, que ha demostrado ser mucho más exitoso, se basa, no obstante, en utilizar minería de datos para extraer electrónicamente todos los genes que codifican antígenos específicos de 15 cáncer, los cuales son accesibles en la superficie celular, y luego evaluar dichos genes en expresión ectópica en tumores.

De esta manera, la invención se basa en una estrategia para identificar genes expresados en tumores de manera diferencial. Esta estrategia combina minería de datos de librerías públicas de secuencias ("in silico") con subsiguientes investigaciones experimentales en laboratorio de evaluación ("wet bench" o banco de trabajo para 20 ensayos por vía húmeda) .

Una estrategia combinada con base en diferentes textos bioinformáticos hizo posible de acuerdo con la invención la identificación del gen descrito en el ejemplo 1, el cual codifica un antígeno disponible en la superficie celular, específico de cáncer. La identificación y la provisión de este gen asociado a tumor y del producto génico codificado de esta manera se efectuaron de modo independiente de su acción inmunogénica. 25

Tal como se representa detalladamente en el ejemplo 1, el antígeno asociado a tumor de la invención puede usarse debido a su expresión específica de tumor como marcador diagnóstico para enfermedades cancerosas en el área de la cabeza-cuello y para leucemias. La solicitud PCT WO2005/021793 describe marcadores fetales de ARN en sangre materna que pueden emplearse para diagnóstico prenatal del síndrome de Down. En este contexto también se describe la secuencia de ácido nucleico denominada "SEQ ID NO: 13", la cual es idéntica... [Seguir leyendo]

1. Método para el diagnóstico o el control de una enfermedad cancerosa que se caracteriza porque se sobreexpresa un antígeno asociado a tumor en un tejido tumoral, en comparación con un tejido sano comparable, y el método comprende (i) la detección de un ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a tumor, y/o 5

(ii) la detección del antígeno asociado a tumor

en una muestra biológica aislada de un paciente, en cuyo caso el antígeno asociado a tumor presenta una secuencia que es codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 13 del protocolo de secuencias, y la enfermedad cancerosa es un carcinoma en el área de cabeza-cuello o una leucemia. 10

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la detección del ácido nucleico se efectúa con una sonda de polinucleótido que se híbrida específicamente con el ácido nucleico o se efectúa mediante amplificación selectiva del ácido nucleico.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la detección del antígeno asociado a tumor se efectúa con un anticuerpo que se enlaza específicamente al antígeno asociado a tumor. 15

4. Utilización de un anticuerpo que se enlaza a un antígeno asociado a tumor y se acopla con un medio de diagnóstico para la preparación de una composición farmacéutica para el diagnóstico o el control de una enfermedad cancerosa, y la utilización se caracteriza porque el antígeno asociado a tumor se sobreexpresa en tejido tumoral en comparación con tejido sano comparable, en cuyo caso el antígeno asociado a tumor presenta una secuencia codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 13 del protocolo 20 de secuencias, y la enfermedad cancerosa es un carcinoma en el área de cabeza-cuello o una leucemia.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 3 o utilización de acuerdo con la reivindicación 4, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado.

6. Método o utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-5, donde el antígeno asociado a tumor comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ 10 NO: 14 del protocolo de secuencias. 25

7. Utilización de un kit para detectar una enfermedad cancerosa que se caracteriza porque se sobreexpresa un antígeno asociado a tumor en tejido tumoral en comparación con tejido sano comparable, en cuyo caso el kit comprende medios para detectar (i) el ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a tumor, y/o (ü) el antígeno asociado a tumor, 30

y el antígeno asociado a tumor presenta una secuencia que se codifica por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 13 del protocolo de secuencias, y la enfermedad cancerosa es un carcinoma en el área de cabeza-cuello o una leucemia.

8. Utilización de acuerdo con la reivindicación 7, donde los medios para detectar el ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a tumor son moléculas de ácido nucleico para la amplificación selectiva del ácido nucleico. 35