Células mesenquimatosas y osteoblastos procedentes de células madre embrionarias humanas.

Un medio de cultivo para obtener osteoprogenitores y/u osteoblastos a partir de células madre embrionarias humanas (hES) o su progenie,

que comprende BMP4, dexametasona y ácido ascórbico o uno de sus análogos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2002/020998.

Solicitante: Asterias Biotherapeutics, Inc.

Inventor/es: THIES,R. SCOTT, XU,CHUNHUI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61L27/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61L PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES U OBJECTOS EN GENERAL; DESINFECCION, ESTERILIZACION O DESODORIZACION DEL AIRE; ASPECTOS QUIMICOS DE VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS; MATERIALES PARA VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS (conservación de cuerpos o desinfección caracterizada por los agentes empleados A01N; conservación, p. ej. esterilización de alimentos o productos alimenticios A23; preparaciones de uso medico, dental o para el aseo A61K). › Materiales para prótesis o para revestimiento de prótesis (prótesis dentales A61C 13/00; forma o estructura de las prótesis A61F 2/00; empleo de preparaciones para la fabricación de dientes artificiales A61K 6/80; riñones artificiales A61M 1/14).
  • C12N15/09 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N5/02 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Propagación de células individuales o de células en suspensión; Su conservación; Medios de cultivo para este fin.
  • C12N5/077 C12N 5/00 […] › Células mesenquimales, p. ej. Células óseas, células cartilaginosas, Células del estroma de la médula ósea, células adiposas o células musculares.
  • C12N5/0775 C12N 5/00 […] › Células madre mesenquimales; Células madre derivadas de tejido adiposo.
  • C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12Q1/02 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen microorganismos vivos.
  • G01N33/15 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › preparaciones medicinales.
  • G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).

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Fragmento de la descripción:

Células mesenquimatosas y osteoblastos procedentes de células madre embrionarias humanas CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere a un medio de cultivo y un entorno de crecimiento para obtener osteoprogenitores y/u osteoblastos, utilizando condiciones de cultivo especiales y técnicas de selección.

ANTECEDENTES

La medicina regenerativa es una iniciativa nueva importante en la industria biotecnológica. Se están desarrollando métodos para producir cultivos de células especializadas cuyo uso se propone para promover la reparación tisular y la curación de enfermedades para las cuales las pautas terapéuticas previas son insatisfactorias.

Un área de interés emergente es el uso de células cultivadas para reforzar o reparar los tejidos óseos. Existen varios informes publicados de células progenitoras de osteoblastos y células madre mesenquimatosas en desarrollo.

Las patentes de los EE. UU. 5 691 175, 5 681 71 y 5 693 511 (Fundación Mayo) describen células osteoblásticas fetales humanas normales inmortalizadas que expresan un mutante sensible a la temperatura del antígeno T grande del virus del simio 4. La patente de los EE. UU. 5 972 73 (Michigan) publica composiciones de células precursoras óseas que no son hematopoyéticas y que se pueden diferenciar en osteoblastos tras la exposición a un factor de crecimiento óseo y depositan calcio en la matriz extracelular. La patente de los EE. UU. 6 2 62 (DuPuy Orthopaedics) publica el aislamiento de células precursoras óseas o de cartílago a partir de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas y propone su uso en la regeneración del hueso y el cartílago.

La publicación de patente internacional WO 95/22611 (Michigan) publica métodos para transferir ácidos nucleicos a células óseas in situ para estimular las células progenitoras óseas. Se exploran los genes osteotrópicos y de colágeno de tipo II para su uso para promover el crecimiento, reparación y regeneración óseos en un modelo en animales. La publicación de patente internacional WO 99/39724 (Oregón) propone tratar defectos óseos con células progenitoras de osteoblastos. Las células se podrán transformar para expresar una proteína morfogenética ósea tal como BMP-2.

J.E. Aubln (J. Cell Biochem. Supl. 3/31:73, 1998) revisa el tema de las células madre óseas. Los osteoprogenitores primitivos y madre y los precursores mesenquimatosos relacionados contribuyen al reemplazo de los osteoblastos en el recambio óseo y en la curación de las fracturas. El artículo formula la hipótesis de que el fenotipo de los osteoblastos maduros es heterogéneo con subpoblaciones de osteoblastos que expresan subconjuntos de los marcadores de osteoblastos conocidos, lo que da lugar a la posibilidad de múltiples rutas de diferenciación paralelas y diferentes reservas de progenitores.

Joyner ef al. (Bone 21:1, 1997) publican la identificación y enriquecimiento de células osteoprogenitoras humanas utilizando un anticuerpo monoclonal específico de la etapa de diferenciación. Se seleccionó un anticuerpo particular por su reactividad con cultivos de médula y ubicación inmunohlstoquímlca en tejidos fetales en regiones celulares progenitoras adyacentes a las células osteoblásticas. En la inmunopreclpitación con anticuerpos inmovilizados sobre una superficie sólida, el anticuerpo seleccionó unidades formadoras de colonias estromales (CFU-F, por sus siglas en Inglés). Thles et al. (Endocrínology 13:1318, 1992) publican que la proteína 2 morfogenética ósea induce la diferenciación osteoblástlca en una línea de células estromales, e Incrementa la actividad fosfatasa alcalina de manera dependiente de la dosis sin afectar a la proliferación celular.

Llechty et al. (Nature Med. 6:1282, 2) publican que las células madre mesenquimatosas humanas (MSC, por sus siglas en Inglés) se injertan y muestran una diferenciación específica del sitio después del trasplante en el útero en ovejas. Se obtuvo una población de MSC por aspiración en la cresta ilíaca de donantes humanos normales y se trasplantó en ovejas antes del desarrollo de la competencia ¡nmunológica. Las células se Injertaron y permanecieron en múltiples tejidos durante 13 meses. El artículo publica que experimentaron diferenciación específica del sitio en condrocltos, adlpocltos, miocitos, cardiomiocltos, células estromales de médula ósea y estroma tímlco.

La patente de los EE. UU. 5 98 784 (Case Western Reserve) se refiere a la obtención de MSC humanas tomando células de médula ósea, cultivándolas en medio BGJ* con suero bovino fetal e Identificándolas utilizando un anticuerpo monoclonal. La inducción de condrocltos in vitro conlleva poner en contacto un sedimento de células empaquetadas con un agente condroinductor. La patente de los EE. UU. 5 486 359 (Osiris Therapeutics) publica el aislamiento de células madre mesenquimatosas humanas que se pueden diferenciar en hueso, cartílago, músculo o estroma medular. La publicación de patente Internacional WO 97/4137 (Osiris) propone un sistema para la regeneración y aumento de hueso utilizando células madre mesenquimatosas. Las composiciones comprenden MSC o células de médula ósea fresca con un material cerámico o biopolímero reabsorblble.

No está claro si alguna de las preparaciones celulares ejemplificadas en estas publicaciones se puede producir en cantidades suficientes para su comercialización masiva como una composición terapéutica para la reparación ósea.

Células madre pluripotentes indiferenciadas de origen embrionario

Un área diferente de investigación médica trata sobre células madre que no están dedicadas a producir una progenie de ningún linaje particular. Varios descubrimientos recientes han generado expectativas sobre líneas celulares embrionarias que podrán convertirse en una fuente de células y tejidos útiles en medicina regenerativa para una amplia variedad de afecciones degenerativas. Las células madre embrionarias se describen como pluripotentes debido a que se consideran capaces de diferenciarse en varios tipos celulares (R.A. Pedersen, Scientif. Am. 28(4):68, 1999).

Se realizó un trabajo inicial con células madre embrionarias utilizando cepas de ratón endogámico como modelo (revisado en Robertson, Meth. Cell Biol. 75:173, 1997; y Pedersen, Reprod. Fértil. Dev. 6:543, 1994). Sin embargo, comparadas con las células ES de ratón, las células pluripotentes de monos y seres humanos han mostrado ser mucho más frágiles y no responden a las mismas condiciones de cultivo. Los factores que afectan a su persistencia en el cultivo y su diferenciación posterior son considerablemente diferentes. Tan solo recientemente, se han realizado descubrimientos que permiten que las células embrionarias de primates se cultiven ex vivo.

Thomson et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995) fueron los primeros en cultivar con éxito células madre embrionarias de primates, utilizando monos rhesus y titfs como modelo. Posteriormente obtuvieron líneas de células madre embrionarias humanas (hES) a partir de blastocistos humanos (Science 282:114, 1998), cocultivándolas con fibroblastos embrionarios de ratón para favorecer su mantenimiento y crecimiento. Gearhart y colaboradores obtuvieron líneas de células germinales embrionarias humanas (hEG) a partir de tejido de gónadas fetales (Shamblott et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998), también favorecidas por células alimentadoras. Tanto las células hES como las hEG tienen las características que se han buscado durante tanto tiempo de las células madre pluripotentes: son capaces de una proliferación continua in vitro sin diferenciarse, retienen un cariotipo normal y retienen la capacidad de diferenciarse para producir vahos tipos de células adultas.

Geron Corporation ha desarrollado entornos para el cultivo tisular novedoso que permiten la proliferación continua de células madre pluripotentes en un entorno esencialmente exento de células alimentadoras. Remítase a la patente australiana AU 729377 y a la publicación de patente internacional WO 1/51616. La posibilidad de cultivar células madre en un entorno exento de células alimentadoras proporciona un sistema en el que las composiciones celulares se pueden producir fácilmente que cumple los requisitos reglamentarios para la terapia en seres humanos.

Con el fin de convertir en realidad el potencial de las células madre pluripotentes en la gestión de la enfermedad y salud humanas, es necesario ahora desarrollar nuevos métodos para convertir estas células en poblaciones de tipos tisulares terapéuticamente importantes.

COMPENDIO

De acuerdo con el primer aspecto de la Invención, se proporciona un medio de cultivo para obtener osteoprogenitores y/u osteoblastos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un medio de cultivo para obtener osteoprogenitores y/u osteoblastos a partir de células madre embrionarias humanas (hES) o su progenie, que comprende BMP4, dexametasona y ácido ascórbico o uno de sus análogos.

2. El medio de cultivo de la reivindicación 1, que comprende además beta-glicerofosfato.

3. Un entorno de crecimiento que comprende un medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 1 o la

reivindicación 2 y una estructura de soporte.


 

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