Composiciones y métodos para inhibir la expresión de transtiretina.

Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de transtiretina (TTR),

en el que dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hebra complementaria, comprendiendo la hebra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifica transtiretina (TTR), en el que dicha región de complementariedad tiene 19 nucleótidos de longitud, la hebra complementaria comprende la SEC ID Nº 170 y cada hebra del ARNds tiene 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud.

Composiciones y métodos para inhibir la expresión de transtiretina.

La invención se refiere a un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) que fija como objetivo un gen de la transtiretina (TTR) y métodos para usar el ARNds para inhibir la expresión de TTR.

La transtiretina (TTR) es una proteina de unión a hormonas tiroideas, segregada. La TTR se une y transporta proteina de unión a retinol (PUR)/Vitamina Ay tirosina en suero (T4) en plasma y liquido cefalorraquídeo.

Tanto la TTR de secuencia normal como la TTR de secuencia variable producen amiloidosis. La TTR de secuencia normal produce amiloidosis cardíaca en personas que son mayores y se denomina amiloidosis sistèmica senil (SSA, por sus siglas en inglés) (también denominada amiloidosis cardíaca senil (SCA, por sus siglas en inglés)). La SSA con frecuencia va acompañada de depósitos microscópicos en otros muchos órganos. Las mutaciones de la TTR aceleran el proceso de formación amiloide de TTR y son el factor de riesgo más importante para el desarrollo de amiloidosis de TTR clínicamente significativa (también denominada ATTR (por sus siglas en inglés) (tipo amiloidosis - transtiretina)). Se sabe que más de 85 variantes de TTR amiloidogénicas producen amiloidosis familiar sistèmica. El hígado es el principal sitio de expresión de TTR. Otros sitios de expresión significativos incluyen el plexo coloideo, la retina y el páncreas.

La amiloidosis por TTR se manifiesta de diversas formas. Cuando se ve afectado el sistema nervioso periférico más destacadamente, la enfermedad se denomina polineuropatía amiloidótica familiar (FAP, por sus siglas en inglés). Cuando está implicado principalmente el corazón pero no el sistema nervioso, la enfermedad se denomina cardiomiopatía amiloidótica familiar (FAC, por sus siglas en inglés). Un tercer tipo principal de amiloidosis por TTR se denomina amiloidosis leptomeningea/del SNC (Sistema Nervioso Central).

Se ha demostrado que las moléculas de ARN bicatenarias (ARNds) bloquean la expresión gènica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia por ARN (ARNi). La patente internacional WO 99/32619 Fire ef a/J describe el uso de un ARNds de al menos 25 nucleótidos de longitud para inhibir la expresión de genes en C. e/egans. Se ha demostrado también que el ARNds degrada el ARN objetivo en otros organismos, incluyendo las plantas (véase, por ejemplo, la patente internacional WO 99/53050, Waterhouse ef a/, y la patente internacional WO 99/61631, Heifetz ef a/J, DrosopMa (véase, por ej. yang, D., ef a/, Curr. B/o/. (2.000) 10: 1.191- 1.200) y mamíferos (véase la patente internacional WO 00/44895, Limmer y la patente alemana DE 101 00 586.5, Kreutzer ef a/).

La patente de EE UU. 20070207974 describe los ARNsi funcionales ehiperfuncionales. La patente de EE UU. 20090082300 describe moléculas antisentido dirigidas contra TTR. La Patente de EE UU. N° 7.250.496 describe microARNs dirigidos contra TTR.

Stein et al. (The Journal of Neuroscience 24, 7.707-7.717 (2.004)) describen que la neutralización de la transtiretina invierte los efectos neuroprotectores de la proteina precursora amiloide secretada en ratones. Kurosawa et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications 337, 1.012-1.018 (2.005)) describen la eliminación selectiva de un alelo de transtiretina mutante por los ARN de interferencia pequeños.

La invención se define por las reivindicaciones.

En un aspecto, la invención proporciona un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR), en la que dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hebra complementaria, comprendiendo la hebra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifique transtiretina (TTR), en la que dicha región de complementariedad tiene 19 nucleótidos de longitud, la hebra complementaria comprende la SEC ID N° 170 y cada hebra del ARNds tiene 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud.

También se describe un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de la transtiretina (TTR), en la que dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hembra complementaria, comprendiendo la hembra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifica la transtiretina (TTR), en la que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud y la hebra complementaria comprende 15 o más nucleótidos contiguos de la SEC ID N° 170, SEC ID N° 450, SEC ID N° 730 o SEC ID N° 1.010. La hebra transcrita también puede comprender 15 o más nucleótidos contiguos de la SEC ID N° 169, SEC ID N° 449, SEC ID N° 729 o SEC ID N° 1.009.

En otra realización, la hebra transcrita consta de la SEC ID N° 449 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N° 450. En otra realización relacionada más, la hebra transcrita consta de la SEC ID N° 729 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N° 730. En otra realización relacionada más, la hebra transcrita consta de la SEC ID N° 1.009 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N° 1.010. El ARNds también puede comprender una hebra transcrita seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16 y una hebra complementaria seleccionada de las Tablas 3A, 3B, 4, 6A, 6B, 7 y 16.

Según la invención, la región de complementariedad entre la hebra complementaria del ARNds y el ARNm que codifica la transtiretina tiene 19 nucleótidos de longitud. También se describe una región de complementariedad que consta de la SEC ID N° 169. Según la invención, cada hebra del ARNds tiene 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud. En otra realización, cada hebra tiene 21 nucleótidos de longitud.

También se describe un ARNds para inhibir la expresión de la transtiretina que no escinde un ARNm de la TTR entre el nucleótido adenina en la posición 637 de la SEC ID N° 1.331 y el nucleótido guanina en la posición 638 de la SEC ID N° 1.331. El ARNds descrito puede escindir un ARNm de la TTR entre el nucleótido guanina en la posición 636 de la SEC ID N° 1.331 y el nucleótido adenina en la posición 637 de la SEC ID N° 1.331. El ARNds descrito puede hibridar aun ARNm de la TTR entre el nucleótido guanina en la posición 628 de la SEC ID N° 1.331 y el nucleótido uracilo en la posición 646 de la SEC ID N° 1.331.

En otras realizaciones relacionadas, la invención proporciona ARNds de la invención para inhibir la expresión de la transtiretina en la que el ARNds comprende uno o más nucleótidos modificados. En realizaciones relacionadas, se elige al menos un nucleótido modificado (o nucleótidos) del grupo que consiste en: un nucleótido 2'-0-metilo- modificado, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal ligado a un derivado de colesterilo o grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico. En otra realización relacionada, el nucleótido modificado se elige del grupo de: un nucleótido 2'-desoxi-2'-fluoro-modificado, un nucleótido 2-desoxi-modificado, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido 2'-am¡no-mod¡ficado, un nucleótido 2-alquil-modificado, nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende base no natural. En ciertas realizaciones, el ARNds comprende al menos un nucleótido 2'-0-met¡lo-mod¡f¡cado.

En otras realizaciones, se conjuga un ARNds como se describió anteriormente para inhibir la expresión de la transtiretina a un ligando o se formula en una formulación de lípidos. La formulación de lípidos puede ser una formulación de LNP, una formulación de LNP01, una formulación de XTC-SNALP a una formulación de SNALP. La formulación de XTC-SNALP puede ser como sigue: usando 2,2-Dil¡nole¡l-4-d¡met¡laminoet¡l-[1,3]-dioxolano (XTC) con XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una proporción de lípido:ARNs¡ de aproximadamente 7. En otras realizaciones relacionadas más, la hebra transcrita del ARNds consta de la SEC ID N° 1.009 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N° 1.010 y el ARNds se formula en una formulación de XTC- SNALP como sigue: usando 2,2-Dil¡nole¡l-4-d¡met¡lam¡noet¡l-[1,3]-dioxolano (XTC) con un

XTC/DPPC/Colesterol/PEG-cDMA en una proporción de 57,1/7,1/34,4/1,4 y una relación de lípido:ARNs¡ de aproximadamente 7. Alternativamente, un ARNds tal como los descritos anteriormente se puede formular en una formulación de LNP09 como sigue: usando XTC/DSPC/C0I/PEG2000-CI4 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una relación de lípido:ARNs¡ de aproximadamente 11:1. En otra variación, el ARNds se formula en una formulación de LNP11 como sigue: usando MC3/DSPC/C0I/PEG2000-CI4 en una proporción de 50/10/38,5/1,5 % en moles y una relación de lípido:ARNs¡... [Seguir leyendo]

1. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para inhibir la expresión de transtiretina (TTR), en el que dicho ARNds comprende una hebra transcrita y una hebra complementaria, comprendiendo la hebra complementaria una región complementaria a una parte de un ARNm que codifica transtiretina (TTR), en el que dicha región de complementariedad tiene 19 nucleótidos de longitud, la hebra complementaria comprende la SEC ID N° 170 y cada hebra del ARNds tiene 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos de longitud.

2. El ARNds según la reivindicación 1, en el que:

(a) la hebra transcrita consta de la SEC ID N° 449 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N° 450;

(b) la hebra transcrita consta de la SEC ID N° 729 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N° 730 o

(c) la hebra transcrita consta de la SEC ID N° 1.009 y la hebra complementaria consta de la SEC ID N° 1.010.

3. El ARNds según la reivindicación 1, en el que la hebra transcrita comprende la SEC ID N° 169.

4. El ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho ARNds comprende al menos un nucleótido modificado.

5. El ARNds según la reivindicación 4, en el que al menos uno de dichos nucleótidos modificados se elige del grupo de: un nucleótido 2'-0-metllo-modlf¡cado, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotloato, un nucleótido terminal ligado a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecllamlda de ácido dodecanoico, un nucleótido 2'-desox¡- 2'-fluoro-mod¡f¡cado, un nucleótido 2-desoxi-modlflcado, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abáslco, un nucleótido 2'-am¡no-mod¡f¡cado, un nucleótido 2'-alqu¡l-mod¡f¡cado, nucleótido de morfolino, un fosforamldato y un nucleótido que comprende base no natural.

6. El ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ARNds está conjugado a un ligando.

7. El ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ARNds se formula en una formulación de lípldos.

8. Un ácido ribonucleico bicatenario (ARNds) para Inhibir la expresión de transtiretina (TTR), en el que dicho ARNds comprende una hebra complementaria que comprende una región complementaria a 19 nucleótidos de 618-648 nucleótidos de la SEC ID N° 1.331 y en el que dicha hebra complementaria empareja base con la guanina en la posición 628 de la SEC ID N° 1.331.

9. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica ambas hebras del ARNds según las reivindicaciones 1 a 8.

10. Una célula

(a) que contiene el ARNds según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o

(b) que comprende el vector según la reivindicación 9.

11. Una composición farmacéutica para inhibir la expresión de un gen de la TTR que comprende el ARNds según las reivindicaciones 1 a 8 y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Un método para inhibir la expresión de la TTR en una célula, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la célula con el ARNds según las reivindicaciones 1 a 8 y

(b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación de la transcripción de ARNm de un gen de la TTR, Inhibiendo de ese modo la expresión del gen de la TTR en la célula;

siempre que se excluya cualquier método de tratamiento del cuerpo del ser humano o del animal por terapia.

13. Un ARNds según las reivindicaciones 1 a 8, para uso en el tratamiento en un ser humano de un trastorno mediado por expresión de la TTR, en el que:

(a) el ser humano presenta amiloidosis por transtiretina y/o

(b) el ser humano presenta un trastorno hepático.

14. El ARNds para uso según la reivindicación 13, en el que dicho ARNds se tiene que administrar al ser humano a

aproximadamente 0,01; 0,1; 0,3; 0,5; 1,0; 2,5 ó 5,0 mg/kg.

15. El ARNds para uso según la reivindicación 13 ó 14, en el que el ser humano recibe adlclonalmente un método terapéutico para tratar una amlloldosis por TTR, el método terapéutico seleccionado del grupo que consiste en: diuréticos, Inhibidores de la enzima de conversión de anglotensina, bloqueadores de los receptores de anglotenslna,

5 diálisis o un trasplante de hígado.

16. El ARNds para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicha amlloldosis por transtlretlna se selecciona de: polineuropatía amlloldótica familiar (FAP), cardiomlopatía amlloldótlca familiar (FAC), amlloldosis leptomeningea/del SNC, amlloldosis sistèmica senil (SSA) y amlloldosis cardíaca senil (SCA).

17. El ARNds para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el ARNds se administra al 10 ser humano a Intervalos de no más de 1, 2, 3 o 4 semanas.

18. El ARNds para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que dicho ARNds se tiene que administrar por vía Intravenosa o por Infusión intravenosa durante un tiempo de 15 minutos.