Métodos y composiciones para modular la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo urocinasa.

Una molécula antagonista que inhibe la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo prourocinasa (pro-uPA) para su uso en un método para tratar cáncer en un sujeto,

en donde la molécula antagonista comprende:

(i) un polipéptido que comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD);

(ii) al menos una porción del inhibidor-1, -1B o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B o HAI-2);

(iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias con pro-uPA y que puede unirse a hepsina y que carece de un sitio de escisión de hepsina.

Métodos y composiciones para modular la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo urocinasa

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica prioridad bajo la Sección 119 del Título 35 del USC a la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/805.584, presentada el 22 de junio de 2006.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a los campos de la biología molecular y la regulación de factores de crecimiento. Más específicamente, la invención se refiere a moduladores de la activación enzimática del activador de plasminógeno de tipo urocinasa, y usos de dichos moduladores.

Antecedentes

La hepsina es una serina proteasa de transmembrana de tipo II (TTSP) expresada sobre la superficie de células epiteliales. La proteína de 417 aminoácidos está compuesta por un dominio citoplásmico del extremo N corto, un dominio transmembrana y un único dominio rico en cisteína de receptor depurador que se compacta estrechamente contra el dominio de proteasa del extremo C (1) . La función fisiológica de la hepsina no está clara. A pesar de su expresión en las fases muy tempranas de la embriogénesis (2) , los ratones deficientes en hepsina fueron viables y se desarrollaron normalmente (3, 4) . Se encontró que la hepsina no era esencial para la regeneración del hígado y para las funciones fisiológicas relacionadas con la coagulación (3, 4) . Sin embargo, la hepsina participa en el cáncer 25 de ovario ( (5 y el documento WO2001/62271) y de próstata (6-11) , en los que varios estudios de expresión génica la han identificado como uno de los genes más altamente inducidos. Se encontró que los niveles de ARN de hepsina eran bajos en próstata normal e hiperplasia benigna, pero fuertemente elevados en carcinoma de próstata, particularmente en estadios avanzados (7-10) . La tinción de la proteína hepsina con un anticuerpo anti-hepsina monoclonal mostró que la expresión de la hepsina era la mayor en sitios de metástasis al hueso y en tumores primarios de estadio tardío (12) , que está de acuerdo con el hallazgo de que niveles de ARN de hepsina elevados se correlacionaron con mayores grados de Gleason y progresión tumoral (9-10, 13) . A diferencia, usando un anticuerpo diferente, Dhanasekaran et al. (6) encontraron la mayor expresión de hepsina en lesiones intra-neoplásicas de próstata anaplásico y menor expresión en carcinoma primario y en lesiones metastásicas. Estos estudios plantearon la cuestión de si la hepsina participaba en el cáncer de próstata. Estudios in vitro no proporcionaron respuestas claras, y dependiendo de las condiciones experimentales usadas, se encontró que la hepsina promovía, inhibía o no afectaba el crecimiento de células tumorales (12, 14, 15) .

La evidencia de una función de la hepsina en el cáncer de próstata provino de un estudio reciente por Klezovitch et al. (16) que demostró que en un modelo de ratón de cáncer de próstata no metastatizante, la expresión en exceso de hepsina condujo a la progresión de tumor primario y metástasis. Curiosamente, la expresión en exceso de hepsina se asoció a rotura de la membrana basal (16) , indicando hacia la posibilidad de que la actividad de la hepsina estuviera algo asociada a la degradación de componentes de la membrana basal. In vitro, la hepsina pudo convertir el factor de crecimiento latente el pro-factor de crecimiento de hepatocitos (pro-HGF) en su forma bicatenaria activa (HGF) , que indujo la señalización del receptor de Met (17, 18, documento WO2006/014928) .

Debido a que la ruta de HGF/Met participa en el crecimiento tumoral invasivo y la metástasis, es posible que la expresión en exceso de la hepsina active el eje de HGF/Met en cáncer de próstata. También se mostró que la hepsina escindía otros sustratos in vitro, principalmente proteínas relacionadas con la coagulación (17, 19) . Sin embargo, no se conoce su función en la tumorigénesis.

En vista de los defectos de la membrana basal que se asociaron a la expresión en exceso de la hepsina en la próstata de ratón, los presentes inventores supusieron que la hepsina podría activar zimógenos de proteasa que están directamente asociados a la degradación de la membrana basal. Se sabía de estudios previos que la hepsina no activa el plasminógeno (18) .

El perfil de expresión de la hepsina en tejidos con cáncer como se ha descrito anteriormente, acoplado a su posible función en actuar de regulador de factores celulares, cuya desregulación podría subyacer la carcinogénesis, sugiere que la modulación de la interacción de hepsinas con tales factores celulares podría demostrar ser un enfoque terapéutico eficaz. A este respecto, hay una clara necesidad de un entendimiento completo de sustratos fisiológicos para hepsina. La invención cumple esta necesidad y proporciona otros beneficios.

El documento WO 01/57194 desvela un inhibidor de MTSP (tal como, por ejemplo, la serina proteasa de tipo membrana MTSP1) (antagonista) que puede ser un anticuerpo, o un inhibidor de la activación de MTSP, por tanto de interacción entre la MTSP y el sustrato (tal como, por ejemplo, sc-uPA, o pro-tPA) . También se desvelan otras MTSP tales como el antígeno prostático específico (PSA) ; o hepsina; o gen similar a serina proteasa, denominado 65 específico 1 de células epiteliales normales (NES1) .

El documento US 2004/009911 se refiere a moléculas escindibles por hepsina que tienen un sitio de escisión de hepsina. El documento US 2004/009911 describe tales moléculas escindibles por hepsina asociadas a un resto inhibidor capaz de la inactivación de hepsina como inhibidores de hepsina, y profármacos con tales moléculas escindibles por hepsina asociados a un resto de modulación de células para la liberación.

Divulgación de la invención

En el presente documento se desvela que la hepsina no escinde activador del plasminógeno de tipo pro-tisular (protPA) , pero convierte eficazmente pro-uPA en uPA de alto peso molecular por la escisión en el enlace peptídico Lys158-Ile159 (P1 -P1') . El reconocimiento de una Lys como el residuo P1 fue sorprendente, ya que otros estudios mostraron que la hepsina prefiere Arg con respecto a Lys en la posición P1. Aún, el modelado estructural soportó los hallazgos experimentales, que indican que el péptido escindible por pro-uPA se acomodó fácilmente en el sitio activo de hepsina. Además, el uPA generado por hepsina mostró actividad enzimática hacia sustratos sintéticos y macromoleculares pequeños indistinguibles de uPA producido por plasmina. La eficiencia catalítica de la activación de pro-uPA por hepsina (kcat/Km 4, 8 x 105 M-1 s-1) fue similar a la de plasmina, que se considera el activador de prouPA más potente, y fue aproximadamente 6 veces superior a la de matriptasa. La conversión de pro-uPA también se demostró con hepsina de longitud completa expresada en la superficie celular. Una línea celular de LnCaP que expresa en exceso hepsina estable convirtió pro-uPA en uPA de alto peso molecular a una tasa de 6, 6 ± 1, 9 nM uPA h-1, que fue aproximadamente 3 veces superior a la de células LnCaP que expresan menores niveles de hepsina sobre su superficie. Se concluyó que la hepsina puede desempeñar una función en activar pro-uPA para iniciar las rutas proteolíticas mediadas por plasmina en la superficie de separación tumor/estroma, conduciendo a la rotura de la membrana basal y progresión del tumor.

Como se describe en el presente documento, un sustrato fisiológico para la hepsina es el activador de plasminógeno de tipo pro-urocinasa, que es un zimógeno de proteasa que está directamente asociado a la degradación de la membrana basal y otras funciones fisiológicas asociadas a diversos aspectos del desarrollo del cáncer. Se muestra en el presente documento que la hepsina escinde pro-uPA con potente actividad, produciendo uPA activado que presenta actividades enzimáticas normales. La invención proporciona métodos y composiciones basadas al menos en parte en estos hallazgos, que se describen en detalle en el presente documento. La hepsina y su interacción con pro-uPA es una diana única y ventajosa para un mayor ajuste en el diseño de enfoques profilácticos y/o terapéuticos contra afecciones patológicas asociadas a actividad proteolítica anormal o no deseada mediada por hepsina y/o uPA/plasmina. Así, la invención proporciona métodos, composiciones, kits y artículos de fabricación para identificar y para usar sustancias que pueden modular la ruta proteolítica mediada por hepsina y/o uPA/plasmina mediante la modulación de interacciones moleculares que participan en la regulación de la activación de uPA.

Por consiguiente, la solicitud proporciona un método de cribado... [Seguir leyendo]

1. Una molécula antagonista que inhibe la activación por hepsina del activador de plasminógeno de tipo pro

urocinasa (pro-uPA) para su uso en un método para tratar cáncer en un sujeto, en donde la molécula antagonista 5 comprende:

(i) un polipéptido que comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD) ;

(ii) al menos una porción del inhibidor-1, -1B o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B o HAI-2) ;

(iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias con pro-uPA y que puede unirse a hepsina y que carece de un sitio de escisión de hepsina.

2. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1, en la que la secuencia del dominio de Kunitz (KD) comprende una secuencia del dominio 1 de Kunitz (KD-1) . 15

3. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1, en la que la porción del inhibidor-1, -1B o -2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B o HAI-2) comprende una secuencia del dominio de Kunitz (KD) .

4. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 3, en la que la secuencia del dominio de Kunitz (KD) es:

(i) secuencia del dominio 1 de Kunitz (KD-1) del inhibidor-1, -1B del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-1, HAI-1B) , o variante de la misma; o (ii) uno o ambos de los dominios de Kunitz del inhibidor-2 del activador del factor de crecimiento de hepatocitos humanos (HAI-2) , o variante de los mismos.

5. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1, en la que un sitio de escisión de hepsina es el enlace peptídico Lys158-Ile159 de pro-uPA. 30

6. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según las reivindicaciones 1 o 5, en la que la secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencias con pro-uPA y que puede unirse a hepsina y que carece de un sitio de escisión de hepsina carece de actividad de uPA.

7. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 6, en donde la molécula es un mutante en el que la cadena ß está mutada o carece de al menos una porción de secuencia de uPA asociada a actividad.

8. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molécula está ligada a una toxina.

9. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 8, en la que la toxina es un agente citotóxico. 45

10. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el método comprende además administrar radiación o un agente quimioterapéutico.

11. La molécula antagonista como se define en la reivindicación 1 para su uso según una cualquiera de las 50 reivindicaciones 1 a 10, en donde el cáncer es de próstata o de ovario.

12. Una composición que comprende una molécula como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo, para su uso en tratamiento como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 u 11.

13. La composición para su uso según la reivindicación 12, en la que el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.