Bioencapsulación del probiótico Shewanella putrefaciens Pdp11 en alimento vivo y aplicaciones.

Son objeto de la presente invención procedimientos de bioencapsulación del probiótico Shewanella putrefaciens Pdp11 en alimento vivo;

el uso de dicho probiótico como modulador del contenido total de proteínas y lípidos, particularmente de ácido docosahexaenoico (DHA), en alimento vivo, particularmente en Artemia; un alimento probiótico que comprende Shewanella putrefaciens Pdp11 bioencapsulado en alimento vivo, particularmente Shewanella putrefaciens Pdp11 bioencapsulado mediante los procedimiento de bioencapsulación también objeto de la presente invención; y usos de dicho alimento probiótico en la modulación de distintos parámetros bioquímicos y procesos biológicos, tales como la ratio DHA / EPA (ácido docosahexaenoico / ácido eicosapentaenoico), la estimulación de la metamorfosis en larvas, o la composición de la microbiota intestinal en larvas; dichos usos comprendiendo la administración de alimento probiótico en pulsos de diferente duración aplicados en diferentes momentos del desarrollo del pez.

Bioencapsulación del probiótico Shewattella yutrefaciens Pdpll en alimento

vivo v aplicaciones

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La invención se enmarca dentro del campo de la acuicultura, y más particularmente dentro del campo de las bacterias probióticas de aplicación en acuicultura.

El objeto de la presente invención lo constituyen procedimientos de bioencapsulación del probiótico Shewanellaputrefaciens Pdpll en alimento vivo y de preparación de alimento probiótico que comprende dicho probiótico bioencapsulado, así como aplicaciones de dicho probiótico y de dicho alimento probiótico en la modulación de parámetros bioquimicos y biológicos en especies de uso en acuicultura, particularmente en larvas y alevines de peces, y más especialmente en peces planos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los principales factores que afectan a la producción de peces, críticos para su éxito comercial, son el control de las enfermedades, el adelanto del destete, el aporte de los requerimientos nutritivos adecuados y la optimización de los protocolos de alimentación (Concei?ao et al, 2007; Engrola et al., 2007; Dimitroglou et ai, 2011). En concreto, en los peces planos, la gran dispersión de tallas es además una cuestión por resolver a nivel industrial (Flos et al, 2001; Salas- Leiton et al, 2010; Sánchez et al., 2010).

Una nutrición larvaria adecuada es un factor decisivo para las siguientes etapas repercutiendo en la calidad de los alevines producidos (Heath & Moore 1997; Dámaso-Rodrigues et al, 2010; Alves-Martins et al., 2011; Boglino) y por tanto en el éxito comercial del cultivo.

El alimento vivo tiene un fuerte impacto en la primera alimentación de peces, y las fluctuaciones que se producen en la microbiota digestiva de las larvas

son reflejo de los microorganismos existentes en las presas vivas ingeridas más que los presentes en el agua de cultivo (Carnevali et al., 2006; Suzer et al., 2008). De este modo, las primeras bacterias que atraviesan el tubo digestivo resultan de gran importancia porque pueden establecerse en el mismo y evolucionar hacia una microbiota que persista en el tiempo (Huys et al., 2001).

El bajo nivel de microbiota autóctona en los estadios larvarios de peces contribuye a la menor digestión de las dietas comerciales (Campbell y Buswell, 1983). Por ello se utilizan protocolos de coalimentación con dietas viva e inerte que mejoran la supervivencia y el crecimiento en larvas de numerosas especies de peces (Caflavate y Fernández-Díaz, 1999; Alves et al., 2006; Engreía et al., 2007). En este sentido un suplemento probiótico con bacterias seleccionadas podría suponer una mejora en la estrategia de alimentación, especialmente durante la metamorfosis y el destete.

Además las larvas de peces están expuestas a desórdenes asociados a la microbiota debido a que comienzan a alimentarse cuando el tracto digestivo no está completamente desarrollado (Stottrup y McEvoy, 2003; Rodríguez et al., 2009) y el sistema inmune está todavía incompleto (Vadstein, 1997). Por esta razón los tratamientos con probióticos son particularmente indicados en estas etapas, cuando la vacunación por inyección no se puede llevar a cabo (Vine et al., 2006; Tinh et al., 2008).

En los últimos años la investigación en probióticos se ha visto incrementada en acuicultura de peces, dados los efectos beneficiosos previamente observados en ganadería (Fulton et al., 2002; Khuntia & Chaudhary, 2002) y humanos (Gilí, 2003; Panigrahi et ah, 2004). Aunque existen investigaciones referentes a la aplicación de bacterias acidolácticas en larvas de peces (Gatesoupe et al., 1989; Gatesoupe, 1992; Carnevali et al., 2006;; Suzer et al., 2008; Abelli et al., 2009; Avella et al., 2010a, 2011), las condiciones ambientales del medio acuático sugieren seleccionar cepas autóctonas de los especímenes ó del medio natural (Chabrillón et al., 2005a, b; Lauzon et ah, 2010).

Este es el caso de Shewanella putrefaciens Pdpl 1, una bacteria aislada de la piel de doradas sanas. Se conoce entre otras su capacidad de protección en peces

(doradas y lenguados) frente a la inoculación con patógenos bacterianos (en concreto frente a Photobacterium damselae subsp. piscicida) y promoción de su bienestar (García de la Banda et al., 2011; Ruíz-Jarabo et al., 2011; Tapia-Paniagua et al., 2011, 2012).. La incorporación de dicho probiótico al pienso de juveniles de lenguado S. senegalensis (Sáenz de Rodrigáfiez et al., 2009; García de la Banda et al., 2010, 2012; Tapia-Paniagua et al., 2010, 2012) y de dorada S. aurata (Salinas et al., 2006; Varela et al., 2010) ha demostrado efectos beneficiosos para el crecimiento y la resistencia frente a enfermedades. Estos positivos resultados son referidos en las solicitudes de patente ES2389364 Al y ES2390428 Al. Sin embargo, los procedimientos descritos en el estado de la técnica que hacen uso de Shewanella putrefaciens Pdpl 1 no se han demostrado igualmente eficaces frente a los principales problemas asociados al cultivo de peces, y especialmente de peces planso, en los primeros estadios, como son: producción de alevines de calidad, necesidad de reducción del consumo de alimento vivo, dificultad en la asimilación del alimento inerte, estancamiento del crecimiento durante el destete, realización de continuas labores de clasificación asociadas a la elevada dispersión de tamaños, susceptibilidad a las especies oportunistas y patógenas del medio de cultivo en especial en el traslado y manipulación de ejemplares.

Con objeto de superar dichos problemas, no resueltos por el estado de la técnica, la presente invención describe y reivindica procedimientos de bioencapsulación del probiótico Shewanella putrefaciens Pdpl 1 en alimento vivo y de preparación de alimento probiótico que comprende dicho probiótico bioencapsulado, así como aplicaciones de dicho probiótico y de dicho alimento probiótico en la modulación de parámetros bioquímicos y biológicos en especies de uso en acuicultura, particularmente en larvas y alevines de peces, y más especialmente en peces planos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Shewanella putrefaciens Pdpl 1 ha sido incorporada como células vivas en alimento vivo (Artemia, rotífero) habitualmente empleado en la alimentación

durante los primeros estadios de cultivo larvario y destete de peces, particularmente de peces planos, más particularmente de peces del género Solea, y más particularmente en lenguado S. senegalensis. Consecuentemente, un primer objeto de la presente invención es un procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putrefaciens Pdpll en alimento vivo que comprende al menos una etapa de incorporación de dicho probiótico a alimento vivo durante un período de tiempo adecuado.

Se ha demostrado un efecto modulador del probiótico así incorporado a alimento vivo, particularmente a Artemia, sobre el contenido total de proteínas y lípidos, particularmente de ácido docosahexaenoico, en dicho alimento vivo; y por tanto es un segundo objeto de la presente invención es el uso de Shewanella putrefaciens Pdpll como modulador del contenido total de proteínas y lípidos, particularmente de ácido docosahexaenoico (DHA), en alimento vivo, particularmente en Artemia

Adicionalmente, de forma previa a la etapa de incorporación del probiótico a alimento vivo puede ser oportuno preparar una solución que comprenda dicho probiótico. De este modo, es objeto de la presente invención un procedimiento de bioencapsulación que comprende, además de la etapa de incorporación del probiótico a alimento vivo, una etapa de preparación de la solución que comprenda las bacterias probióticos.

Alternativamente, de forma previa a la preparación de la solución que comprenda el probiótico puede ser oportuno el cultivo de las bacterias probióticas. Por tanto, es objeto de la presente invención un procedimiento de bioencapsulación que comprende, además de las etapas de preparación de la solución del probiótico Pdpl 1 y de incorporación de dicho probiótico en solución a alimento vivo, una etapa de cultivo de Shewanella putrefaciens Pdpll,

Como resultado del procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putrefaciens Pdpl 1, en cualquiera de las variantes referidas en la presente invención, se obtiene un alimento probiótico. Consecuentemente, es objeto de la presente invención un alimento probiótico que comprende Shewanella putrefaciens Pdpll bioencapsulado en alimento vivo, particularmente Shewanella putrefaciens Pdpll

bioencapsulado mediante una de las varias del procedimiento de bioencapsulación también objeto de la presente invención.

Se ha demostrado un efecto modulador del alimento probiótico que comprende Shewanella putrefaciens Pdpll bioencapsulado... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpll en

alimento vivo caracterizado por que comprende una etapa de incorporación de células vivas de la cepa Pdpl 1 (Shewanella putresfaciens) depositada en la

Colección Española de Cultivos Tipo con referencia CECT 7627 a alimento vivo durante un período de tiempo adecuado.

2. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 en alimento vivo según la reivindicación anterior caracterizado por que el alimento vivo comprende Artemia.

3. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpll en alimento vivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 ó 2 caracterizado por que el alimento vivo comprende rotíferos.

4. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpll en alimento vivo según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 caracterizado por que comprende la adición al alimento vivo de una solución con una concentración de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 comprendida en el rango 2.5*107 - 4.5*107 ufe mL'1,

5. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpll en alimento vivo según la reivindicación anterior caracterizado por que la adición de la solución de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 se realiza entre 3 y 9 horas antes del momento previsto para la administración de Shewanella putresfaciens Pdpll bioencapsulado a los peces.

6. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 en alimento vivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 4 ó 5 caracterizado por que la adición de la solución de Shewanella putresfaciens Pdpll se realiza a un alimento vivo que comprende Artemia en una concentración comprendida en el rango 50-400 individuos mL'1.

7. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpll en alimento vivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 4 a 6 caracterizado por que la adición de la solución de Shewanella putresfaciens

Pdpll se realiza a un alimento vivo que comprende rotífero en una

concentración comprendida en el rango 70-700 individuos mL'\

8. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 en

alimento vivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7

caracterizado por que comprende una etapa de preparación de la solución de

Shewanella putresfaciens Pdpl 1.

9. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpll en alimento vivo según la reivindicación anterior caracterizado por que la etapa de preparación de la solución de Shewanella putresfaciens Pdpll comprende la re suspensión de una masa bacteriana de Shewanella putresfaciens Pdpll en tampón fosfato salino (PBS).

10. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpll en

alimento vivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9

caracterizado por que comprende una etapa de cultivo de Shewanella putresfaciens Pdpl 1.

11. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 en alimento vivo según la reivindicación anterior caracterizado por que la etapa de cultivo de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 comprende (a) su siembra en medio líquido Triptona de Soja suplementado con NaCl hasta el 1,5% de concentración final (TSBs) y (b) la incubación durante 18 horas a 22 °C.

12. Procedimiento de bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpll en alimento vivo según la reivindicación anterior caracterizado por que la etapa de cultivo de Shewanella putresfaciens Pdpll comprende además (c) la toma de alícuotas de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 sembrada e incubada conforme la reivindicación anterior, (d) la siembra de dicha alícuotas en medio sólido de Triptona de Soja suplementado con NaCl hasta el 1,5% de concentración final (TSAs), y (e) la incubación a 22 °C.

13. Uso de Shewanella putresfaciens Pdpll como agente modulador del contenido total de proteínas y lípidos en alimento vivo para peces.

14. Uso de Shewanella putresfaciens Pdpll según la reivindicación anterior como agente modulador del contenido de ácido docosahexaenoico (DHA) en alimento vivo para peces.

15. Uso de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 13 ó 14 caracterizado por que comprende la bioencapsulación de Shewanella putresfaciens Pdpll en alimento vivo mediante un procedimiento conforme al reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 13.

16. Uso de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 caracterizado por que el alimento vivo comprende Artemia.

17. Alimento probiótico que comprende células vivas Shewanella putresfaciens Pdpll bioencapsuladas en alimento vivo.

18. Alimento probiótico según la reivindicación anterior caracterizado por que las células vivas Shewanella putresfaciens Pdpll que comprende han sido bioencapsuladas en alimento vivo mediante un procedimiento conforme al reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 13.

19. Uso de un alimento probiótico reivindicado según cualquiera de las

reivindicaciones anteriores 17 ó 18 como agente modulador de la ratio DHA / EPA (ácido docosahexaenoico / ácido eicosapentaenoico) en peces.

20. Uso de un alimento probiótico reivindicado según cualquiera de las

reivindicaciones anteriores 17 6 18 como agente estimulador de la metamorfosis en larvas de peces.

21. Uso de un alimento probiótico reivindicado según cualquiera de las

reivindicaciones anteriores 17 ó 18 como agente estimulador del crecimiento en larvas de peces.

22. Uso de un alimento probiótico reivindicado según cualquiera de las

reivindicaciones anteriores 17 ó 18 como agente modulador de la composición de la microbiota intestinal en larvas de peces.

23. Uso de un alimento probiótico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 19 a 22 caracterizado por que los peces son peces planos.

24. Uso de un alimento probiótico según la reivindicación anterior caracterizado por que los peces son del género Solea.

25. Uso de un alimento probiótico según la reivindicación anterior caracterizado por que los peces son de la especie Solea senegatensis.

26. Uso de un alimento probiótico según la reivindicación anterior caracterizado por que comprende la adición de Shewanellaputresfaciens Pdpl 1 bioencapsulado en

alimento vivo desde el inicio de la metamorfosis hasta el final del destete de los peces.

27. Uso de un alimento probiótico según la reivindicación anterior caracterizado por que comprende la adición de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 bioencapsulado en alimento vivo entre los días 10 y 86 posteriores a la eclosión (10-86 dpe) de los

huevos de los peces.

28. Uso de un alimento probiótico según la reivindicación anterior caracterizado por que comprende la adición de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 bioencapsulado en alimento vivo entre los días 10 y 30 posteriores a la eclosión (10-30 dpe) de los huevos de los peces.

29. Uso de un alimento probiótico según la reivindicación 25 caracterizado por que

comprende la adición de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 bioencapsulado en alimento vivo al inicio de la alimentación exógena de los peces.

30. Uso de un alimento probiótico según la reivindicación anterior caracterizado por que comprende la adición de Shewanella putresfaciens Pdpl 1 bioencapsulado en

alimento vivo entre los días 2 y 20 posteriores a la eclosión (2 - 20 dpe) de los huevos de los peces.