Método para generar aptámeros con tasas de disociación mejoradas.

Un método para identificar un aptámero que tiene una tasa de disociación (t1/2) lenta de su molécula diana,

en donde el aptámero comprende al menos una pirimidina con una base modificada, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto una mezcla de candidatos con una molécula diana, en donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos se unen a la molécula diana, formando complejos ácido nucleico-molécula diana y en donde la mezcla de candidatos comprende ácidos nucleicos modificados en los que una, varias o todas las pirimidinas en al menos uno, o cada uno, de los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos están modificadas químicamente en la posición 5 para formar una pirimidina con una base modificada;

(b) separar los complejos ácido nucleico-molécula diana de la mezcla de candidatos;

(c) disociar los complejos ácido nucleico-molécula diana para generar ácidos nucleicos libres;

(d) amplificar los ácidos nucleicos libres para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecidos en secuencias que son capaces de unirse a la molécula diana con afinidad aumentada, por lo que se puede identificar un aptámero para la molécula diana;

(e) opcionalmente, repetir (a) a (d) si es necesario;

(f) identificar al menos un aptámero para la molécula diana, en donde el aptámero comprende al menos una pirimidina con una base modificada, y

(g) seleccionar el aptámero(s) identificado en (f) para identificar el aptámero(s) que tiene una tasa de disociación lenta (t1/2) de la molécula diana.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09012809.

Solicitante: Somalogic, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2945 Wilderness Place Boulder, CO 80301 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: GOLD, LARRY, EATON, BRUCE, SCHNEIDER,DANIEL J, ZICHI,DOMINIC, WILCOX,SHERI K, BOCK,CHRIS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2537322_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para generar aptámeros con tasas de disociación mejoradas Campo de la invención

La presente divulgación se refiere en general a métodos para la generación de aptámeros y fotoaptámeros que tienen mejores propiedades y los aptámeros y fotoaptámeros mejorados que se generan de esta manera. En particular, la presente divulgación describe aptámeros con una tasa de disociación lenta que son altamente específicos para una diana de interés. La divulgación describe la composición de estos aptámeros con una tasa de disociación lenta así como los métodos para su selección. Además la divulgación describe construcciones de aptámeros con mejores funcionalidades para los métodos de detección. Además, la divulgación describe aplicaciones habilitadas para estos aptámeros mejorados.

Antecedentes

La siguiente descripción proporciona un resumen de información relevante para la presente divulgación y sin que sea una concesión de que cualquier información proporcionada o las publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento sean anteriores a la invención reivindicada.

El proceso SELEX es un método para la selección in vitro de moléculas de ácido nucleico que son capaces de unirse a moléculas diana con una alta especificidad y se describe en la Patente de EE. UU. N2 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands" y la Patente de EE. UU. N2 5.270.163 (véase también el documento WO 91/19813) titulada "Nucleic Acid Ligands". Estas patentes, que se denominan colectivamente en el presente documento Patentes SELEX, describen métodos para fabricar un aptámero para cualquier molécula diana deseada.

El proceso SELEX básico se ha modificado para conseguir varios objetivos específicos. Por ejemplo, la Patente de EE. UU. N2 5.707.796, titulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure", describe el uso del proceso SELEX en conjunción con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales específicas, tales como el ADN doblado. La Patente de EE. UU. N2 5.580.737, titulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discrimínate Between Theophylline and Caffeine", describe un método para identificar aptámeros altamente específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente relacionadas, llamado Contra-SELEX. La Patente de EE. UU. N2 5.567.588, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", describe un método basado en SELEX que consigue una separación altamente eficaz entre oligonucleótidos que tienen una alta o baja afinidad por una molécula diana. La Patente de EE. UU. N2 5.496.938, titulada "Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev", describe métodos para obtener aptámeros mejorados después de que se haya llevado a cabo el SELEX. La Patente de EE. UU. N2 5.705.337, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX", describe métodos para unir covalentemente un aptámero a su diana.

El proceso SELEX engloba la identificación de aptámeros de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tales como una mejor estabilidad in vivo o unas mejores características de suministro. Ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones químicas en la ribosa y/o el fosfato y/o las posiciones de las bases. Los aptámeros identificados por el proceso SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la Patente de EE. UU. N2 5.660.985, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5 y 2 de las pirimidinas. La Patente de EE. UU. N2 5.580.737, véase supra, describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2-amino (2-NH2), 2-fluoro (2-F), y/o 2-0-metil (2-OMe).

Se describen otras modificaciones del proceso SELEX en la Patente de EE. UU. N2 5.763.177, Patente de EE. UU. N2 6.001.577, y Patente de EE. UU. N2 6.291.184, cada una de las cuales se titula "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; véase también, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N2 6.458.539, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands". Estas patentes, a las que se denomina colectivamente "Las patentes FotoSELEX", describen varios métodos SELEX para seleccionar aptámeros que contienen grupos funcionales fotorreactivos capaces de unirse y/o fotoentrecruzarse con y/o fotoinactivar una molécula diana. Los aptámeros fotorreactivos resultantes se denominan aptámeros de fotoentrecruzamiento o fotoaptámeros.

Aunque estos procesos SELEX y fotoSELEX son útiles, siempre se necesitan procesos que den lugar a aptámeros con propiedades mejoradas que se generen por técnicas de selección in vitro. Por ejemplo, existe una necesidad de aptámeros contra moléculas diana con mejores afinidades de unión que las que se alcanzan con los nucleótidos ADN o ARN de origen natural, así como métodos para producir tales aptámeros. Para muchas aplicaciones, tales como por ejemplo, ensayos in vitro, diagnósticas, terapéuticas, o aplicaciones de diagnóstico por imagen, es interesante producir aptámeros con tasas de disociación lentas del complejo de afinidad aptámero/diana. Se han propuesto varias técnicas para producir tales reactivos (véase por ejemplo, los documentos W099/27133 y

US2005/0003362). Sin embargo, estos procesos de selección no discriminan entre la selección de reactivos que tienen cinéticas de asociación con la diana rápidas (es decir, tasas de asociación rápidas) y la selección de reactivos que tienen cinéticas de disociación con la diana lentas (es decir, tasas de disociación lentas). Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos procesos y técnicas que favorezcan la selección de aptámeros con tasas de disociación lentas a la vez que se inhibe la selección de aptámeros que simplemente tienen una tasa de asociación rápida con la diana.

Finalmente, existe la necesidad de construcciones de aptámero que incluyan diferentes funcionalidades incorporadas. Estas funcionalidades pueden incluir marcadores para inmovilización, marcadores para detección, medios para promover o controlar la separación, etc.

DiDonato, D. A. (Parte II. Synthesis and Evaluation of Modified Nucleotides for DNA Aptamer Selection. University of North Carolina, Raleigh, USA, 9 de agosto de 2006 (09-08-2006). Dissertation, páginas l-XI, 26-115) describe intentos para aumentar la diversidad química del ADN por medio de la síntesis de desoxiuridinas y desoxicitidinas modificadas en las que la funcionalidad se introduce en la posición 5 por medio de una reacción de carboxiam ¡dación.

Davis et al., (Isolation of high-affinity GTP aptamers from partially structured RNA libraries. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 3 SEP 2002" vol. 99, n2 18, 3 de Septiembre de 2002 (03-09-2002), páginas 11616-11621) describe el aislamiento de aptámeros GPT de alta afinidad a partir de bibliotecas de ARN parcialmente estructuradas en las que se utilizó un protocolo de selección por tasa de disociación que implicaba cuatro incubaciones sucesivas de 30 min cada una con un tampón de elución que contenía GPT.

Sumario

La presente divulgación describe nuevos aptámeros, y métodos para producir y utilizar dichos aptámeros. En particular, la divulgación describe aptámeros con una tasa de disociación lenta (tasa lenta de disociación), aptámeros con una tasa de disociación lenta que contienen pirimidinas modificadas en C-5, y procesos para la selección de aptámeros con una tasa de disociación lenta por dilución, por adición de un competidor, o por combinación de ambas estrategias. Además, se describen aptámeros con una tasa de disociación lenta de varias dianas tales como proteínas y péptidos. También se describen aptámeros con una tasa de disociación lenta con características estructurales y temperaturas de fusión únicas. La divulgación también describe aptámeros con una tasa de disociación lenta con grupos funcionales fotorreactivos, aptámeros que son refractarios a la presencia de materiales poli-aniónicos, y un proceso de selección para estos aptámeros, así como aptámeros construidos con otras varias funcionalidades para mejorar su utilidad en varias aplicaciones.

La presente divulgación describe métodos SELEX mejorados para generar aptámeros que son capaces de unirse a moléculas diana. Más específicamente, la presente divulgación describe métodos para producir aptámeros y/o fotoaptámeros que tienen tasas de disociación más lentas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para identificar un aptámero que tiene una tasa de disociación (t^) lenta de su molécula diana, en donde el aptámero comprende al menos una pirimidina con una base modificada, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto una mezcla de candidatos con una molécula diana, en donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos se unen a la molécula diana, formando complejos ácido nucleico-molécula diana y en donde la mezcla de candidatos comprende ácidos nucleicos modificados en los que una, varias o todas las pirimidinas en al menos uno, o cada uno, de los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos están modificadas químicamente en la posición 5 para formar una pirimidina con una base modificada;

(b) separar los complejos ácido nucleico-molécula diana de la mezcla de candidatos;

(c) disociar los complejos ácido nucleico-molécula diana para generar ácidos nucleicos libres;

(d) amplificar los ácidos nucleicos libres para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecidos en secuencias que son capaces de unirse a la molécula diana con afinidad aumentada, por lo que se puede identificar un aptámero para la molécula diana;

(e) opcionalmente, repetir (a) a (d) si es necesario;

(f) identificar al menos un aptámero para la molécula diana, en donde el aptámero comprende al menos una pirimidina con una base modificada, y

(g) seleccionar el aptámero(s) identificado en (f) para identificar el aptámero(s) que tiene una tasa de disociación lenta (ti/2) de la molécula diana.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha pirimidina con una base modificada se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en:

5-(N-benzilcarboxiamida)-2-desoxiuridina,

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2-desoxiuridina,

5-(N-[2-(1 H-indol-3 ¡I) etil] carboxiamida)-2-desoxiuridina,

5-(N-[1-(3-trimetilamonio) propil] carboxiamida)-2-desoxiuridina cloruro,

5-(N-naftilcarboxiamida)-2-desoxiuridina, y

5-(N-[1 -(2,3-dihidroxipropil)] carboxiamida)-2-desoxiuridina.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha pirimidina con una base modificada se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en las pirimidinas con una base modificada que se muestran en la FIG. 14.

4. El método de cada una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho aptámero comprende además al menos una modificación química adicional.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicha al menos una modificación química adicional es una sustitución química en una o más posiciones que se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en una posición de ribosa, una posición de desoxirribosa, una posición fosfato y una posición de una base.

6. El método de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5, en el que dicha al menos una modificación química adicional se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en una modificación en la posición 2 del azúcar, 2-amino (2-NH2), 2-fluoro (2-F), 2-0-metil (2-OMe), una modificación en la posición 5 de la pirimidina, una modificación en una amina exocíclica de citosina, una sustitución de 5-bromouracilo, una sustitución de 5- bromodesoxiuridina, una sustitución de 5-bromodesoxicitidina, una modificación de armazón, metilación, un recubrimiento 3 y un recubrimiento 5.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicha molécula diana se selecciona de entre el grupo que consiste en una proteína, un carbohidrato, un polisacárido, una glucoproteína, una hormona, un receptor, un péptido, un antígeno, un anticuerpo, un virus, un sustrato, un metabolito, un análogo en estado de transición, un cofactor, un inhibidor, un fármaco, un colorante, un nutriente, un factor de crecimiento y un tejido.

8. Un método para identificar un aptámero que tiene una tasa de disociación (ti/2) lenta de su molécula diana, en el que el aptámero comprende al menos una pirimidina con una base modificada, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto una mezcla de candidatos con una molécula diana, en donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos se unen a la molécula diana, formando complejos ácido nucleico-molécula diana y en donde la mezcla de candidatos comprende ácidos nucleicos modificados en los que una, varias o todas las pirimidinas en al menos uno, o cada uno, de los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos están modificadas químicamente en la posición 5 para formar una pirimidina con una base modificada;

(b) separar los ácidos nucleicos con afinidad aumentada del resto de la mezcla de candidatos;

(c) separar los ácidos nucleicos que tienen una tasa de disociación (ti/2) lenta de la molécula diana de la mezcla

de candidatos; y

(d) amplificar los ácidos nucleicos separados para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de unirse a la molécula diana con una afinidad aumentada y que tienen una tasa de disociación (ti/2) lenta de la molécula diana, por lo que se puede identificar un aptámero para una molécula diana que comprende al menos una pirimidina con una base modificada.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicha pirimidina con una base modificada se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en:

5-(N-benzilcarboxiamida)-2-desox¡ur¡dina,

5-(N-isobutilcarbox¡amida)-2-desox¡uridina,

5-(N-[2-(1 H-indol-3il) etil] carboxiam¡da)-2-desoxiuridina,

5-(N-[1-(3-trimet¡lamon¡o) propil] carboxiamida)-2-desoxiuridina cloruro,

5-(N-naft¡lcarbox¡amida)-2-desox¡uridina, y

5-(N-[1 -(2,3-dihidroxipropil)] carboxiamida)-2-desoxiuridina.

10. El método de la reivindicación 8, en el que dicha pirimidina con una base modificada se selecciona independientemente de entre el grupo que consiste en las pirimidinas con una base modificada que se muestran en la FIG. 14.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en el que todos los restos C y/o todos los T y/o todos los U de los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos están modificados químicamente en la posición 5.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 que comprende además la etapa de secuenciación de los ácidos nucleicos de la mezcla de (d), por lo que se identifica un aptámero para dicha diana.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicha tasa de disociación (ti/2) es o bien:

a) mayor o igual a 30 minutos;

b) entre 30 minutos y 240 minutos; o

c) se selecciona entre el grupo que consiste en un tiempo de > 60 min., > 90 min., > 120 min., > 150 min., > 180 min., > 210 y > 240 min.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 en el que la tasa de disociación (ti/2) del/de los aptámero(s) identificado(s) se elige de entre: (i) 30 minutos a 60 minutos (ii) 60 minutos a 90 minutos (iii) 90 minutos a 120 minutos (iv) 120 minutos a 150 minutos (v) 150 minutos a 180 minutos (vi) 180 minutos a 210 minutos (vii) 210 minutos a 240 minutos.


 

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