Neurofilina-1 (NRP-1) urinaria como marcador pronóstico de nefritis y nefritis lúpica.

Neurofilina-1 (NRP-1) urinaria como marcador pronóstico de nefritis y nefritis lúpica.

La presente invención se refiere a los métodos para predecir el progreso de nefritis y nefritis lúpica en un individuo. La presente invención también se refiere a los métodos para evaluar el desarrollo de la nefritis, particularmente la nefritis lúpica, en un individuo y su respuesta a un tratamiento.

Neurofilina-1 (NRP-1) urinaria como marcador pronóstico de nefritis y nefritis lúpica SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCION

La presente invención se encuadra dentro del Ã?rea de la Biotecnología en los sectores de la Industria Farmacéutica. Específicamente la presente invención se refiere al uso de la Neuropilina-1 como biomarcador pronóstico de la nefritis y nefritis lúpica en la práctica clínica.

ESTADO DE LA TECNICA

El Lupus Eritematoso Sistémico (SLE, del inglés Systemic Lupus Er y thematosus) es una enfermedad autoinmune en la cual la afectación renal es uno de los determinantes de mal pronóstico (1 ) . La nefritis lúpica (NL) aparece aproximadamente del 40-75% de los pacientes con SLE y se asocia a un curso impredecible y a un aumento de la morbilidad precoz y tardía (2) . A pesar de la realización de un tratamiento inicial agresivo, hasta un 25% de los pacientes con NL progresará a daño renal (3) siendo esto parcialmente causado por la dificultad para valorar de forma precoz la respuesta al tratamiento. El disponer de un índice predictivo permitiría introducir nuevos tratamientos que podrían modificar el curso de la enfermedad.

En la actualidad, la biopsia renal es el "Gold Standard" para diagnosticar y valorar la respuesta al tratamiento del daño renal, pero debido a su naturaleza invasiva no puede ser realizado de forma seriada. Los biomarcadores serológicos tradicionales como anticuerpos anti-ADN, niveles de complemento así como pruebas de función renal, (proteinuria, sedimento urinario, creatinina y tasa de filtrado glomerular) han demostrado ser insuficientes (4, 5) Y no siempre correlacionan con el daño renal. Hasta ahora estas herramientas diagnósticas no han permitido predecir con fiabilidad la respuesta al tratamiento de estos pacientes hasta finalizar los primeros 6 meses del tratamiento inmunosupresor (6) , siendo las secuelas renales (fibrosis renal) que se produce en este periodo lo que determinará el pronóstico a largo-plazo (7) .

Por esta razón, en los últimos años ha habido un interés creciente en encontrar marcadores no invasivos de nefritis lúpica que puedan ser usados para predecir el inicio de la

enfermedad y también monitorizar su progresión. Entre los biomarcadores, los urinarios, como por ejemplo IL-12, TWEAK, MCP-1 o NGAL, son unos candidatos muy atractivos (8, 9) puesto que además de ser muestras relativamente fáciles de obtener, estas pueden reflejar cambios fisiopatológicos a nivel renal. Sin embargo, hace falta una validación longitudinal en grupos más grandes de pacientes con nefritis lúpica. TWEAK urinario es muy espeCífico de la nefritis lúpica y se correlaciona con el grado de daño renal, aunque no es suficientemente sensible para predecir los episodios de nefritis. En cambio MCP-1 y NGAL son específicos de la actividad renal y pueden predecir episodios de nefritis, pero no se han descrito como marcadores pronóstico de la evolución del lupus. Ninguno de los tres potenciales marcadores urinarios ha sido relacionado con la regeneración renal, ni con la remisión de la enfermedad en estudios longitudinales (8) .

Así pues, a pesar de los esfuerzos realizados todavía hay una necesidad de encontrar nuevos marcadores cuya muestra sea fácil de obtener y tenga un carácter pronóstico capaz de orientar a los facultativos en el mejor tratamiento.

Las neurofilinas (NRP-1 y NRP-2) son unas proteínas transmembrana que interactúan con semaforinas tipo 3, con miembros de la familia del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y ligandos como el factor de crecimiento del hepatocito, factor de crecimiento plaquetar, "transforming growth factor-b1" (TGF-b1) , y el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF2) (10) . Son pues co-receptores del VEGF y co-receptores de factores angiogénicos como el HGF, pudiendo aumentar la actividad angiogénica de éstos. Las neurofilinas han sido implicadas en diferentes procesos biológicos como el crecimiento tumoral y/o, la vascularización, como mediadores de la respuesta inmune primaria, o como inductores en procesos de regeneración y reparación (10) .

Por su parte, el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es una importante citoquina implicada en la angiogénesis, quimiotaxis y permeabilidad vascular (11) , tiene un papel protector en la preservación de la fun ción de los órganos, probablemente mediante el mantenimiento de la función celular y la integridad de endotelio vascular (12) , e induce morfogénesis de las células epiteliales renales de forma NRP-1 dependiente (13) .

El papel de NRP-1 y VEGF en la patogénesis de la nefritis lúpica no ha sido aclarado. Se ha sugerido que niveles elevados de VEGF tienen un importante papel protector en la patología renal (14, 15) Y particularmente en SLE (12, 16-18) donde niveles bajos de VEGF en orina se han asociado a afectación severa y un mal pronóstico (17, 19) ; estos trabajos destacan el

papel de VEGF como pronóstico de la enfermedad renal , pero no diferencian entre las diferentes patologías renales (20) . Otros estudios realizados en pacientes con nefritis lúpica han mostrado también un incremento de NRP-1 a nivel renal en muestras procedentes de biopsias de pacientes con SLE pero no en otras enfermedades (21) . Dado que NRP-1 es un receptor funcional del VEGF se cree que su aumento tiene como significado potenciar el efecto protector del VEGF en las células endoteliales glomerulares, ayudando a prevenir el daño y la apoptosis (17) y de forma específica a SLE ya que se encuentra elevado en tanto en muestras de biopsias renales (17) como en fluido sinovial (22) . Sin embargo, hasta la fecha, los estudios realizados sobre NRP-1 no lo identifican como marcador pronóstico de la enfermedad lúpica ni, particularmente, del desarrollo de la enfermedad en riñón; además hasta ahora se han empleado muestras de biopsias renales, una prueba invasiva no exenta de complicaciones a largo plazo, y que dificulta mucho la rápida identificación de los niveles de NRP-1, así como la posibilidad de hacer un seguimiento de los pacientes y la efectividad de su tratamiento sobre la regeneración renal.

La evaluación de un determinado marcador en orina, capaz de indicar el pronóstico de la enfermedad en el momento del diagnóstico y a lo largo de su tratamiento, permitiría una individualización del tratamiento y una gran mejora en la morbilidad y en la mortalidad de estos pacientes y por lo tanto en su pronóstico y calidad de vida.

EXPLlCACION DE LA INVENCION

EXPLICACiÓN BREVE DE LA INVENCiÓN

Un primer objeto de la invención se refiere al uso del gen Neuropilina 1, NRP1, Y sus productos de expresión como marcador pronóstico de desarrollo de la nefritis, y más preferentemente la nefritis lúpica.

Otro objeto de esta invención se refiere a un método de cuantificación de los niveles de NRP-1 como marcador pronóstico de desarrol lo de la nefritis, preferentemente de la nefritis

lúpica.

Un siguiente objeto de la invención se refiere a un método prim ero d e la inve nción que

permite la cuantificación de los niveles de ácido nucleico en una muestra de orina,

preferentemente ARNm. Preferentemente dicho método es la RT-PCR y más

preferentemente aún la qRT-PCR.

Otro objeto de la invención se refiere a un método segundo de la invención que permite detectar los niveles de la proteína NRP-1 en una muestra, preferentemente en una muestra de orina.

Un siguiente objeto de la invención se refiere a un inmunoensayo que permite la detección de la proteína NRP-1 en una muestra, y más preferentemente a un ELlSA.

Un siguiente objeto de la invención se refiere a un método de espectrofotometría de masas que permite la cuantificación de NRP-1 en una muestra y más preferentemente el SELDI10 TOD, o el MALDI-TOF.

Otro objeto particular de la presente invención se relaciona con un kit para el pronóstico de nefritis, útil para la realización del método primero o segundo de la invención.

Así, otro objeto de la invención es el uso de los métodos primero y segundo de la invención,

o del kit de la invención, para evaluar el desarrollo en pacientes urológicos de nefritis o de nefritis lúpica, o bien para evaluar el efecto de un fármaco o candidato a fármaco en pacientes urológicos con nefritis o nefritis lúpica.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

Los inventores de la presente invención han identificado que los niveles de expresión de NRP-1 en la orina como un biomarcador asociado con la nefritis y, particularmente, con la nefritis lúpica y que es indicador pronóstico de recuperación . El uso de este marcador en 25 orina supone una mejora sustancial... [Seguir leyendo]

1. Uso del gen NRP-1 o sus productos de expresión como biomarcador pronóstico y para la monitorización de la nefritis.

2. Uso del gen NRP-1 o sus productos de expresión según la reivindicación 1 de la nefritis lúpica .

3. Método de cuantificación del biomarcador según las reivindicaciones 1 y 2 útil para el 10 pronóstico o monitorización de la nefritis.

4. Método de cuantificación del biomarcador según la reivindicación 3 útil para el pronóstico o monitorización de la nefritis lúpica.

5-Método según la reivindicaciónes 3 y 4 caracterizado por cuantificar los niveles de ARNm.

6. Método según las reivindicaciones 3 a 5 caracterizado porque la técnica que emplea es la RT-PCR.

7. Método según la reivindicaciones 3 a 6 caracterizado porque la técnica que emplea es la qRT-PCR.

8. Método según la reivindicación 7 caracterizado porque comprende las siguientes etapas o pasos: a) mezclar los ARNm aislados de una muestra con un enzima con actividad retrotranscriptasa y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la amplificación de ADN complementario al ácido nucleico molde empleando un cebador, y

c) realizar la detección en presencia de una molécula fluorescente que permita cuantificar la cantidad de ADNc generado con un detector específico.

9. Método según la reivindicación 8 en el que la detección fluorescente del paso d) es mediante SYBR Green.

10. Método según las reivindicaciones 3 y 4 caracterizado por cuantificar los niveles de proteína NRP-1 .

11. Método según la reivindicación 10 caracterizado por ser un inmunoensayo o una 5 espectrometria de masas.

12. Método según la reivindicación 11 caracterizado por ser un ELlSA.

13. Método según la reivindicación 12 caracterizado por comprender los siguientes pasos:

a) inmovilización de un anticuerpo monoclonal anti-NRP-1 a un soporte, b) incubación con la muestra y captura de la proteína NRP-1 , c) incubación con un anticuerpo policlonal anti-NRP-1 marcado con biotina, d) unión de un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina, e) revelado de la reacción enzimática con un sutrato cromogénico, por ejemplo, el p

nitro!enil!os!ato (p-NPP) , f) análisis de la densidad óptica mediante espectrofometria a la longitud de onda adecuada al sustrato cromogénico empleado.

14. Método según la reivindicación 11 caracterizado por ser SELDI-TOF o MALDI-TOF.

15. Kit pronóstico de nefritis o nefritis lúpica caracterizado por ser útil para la realización del

método según las reivindicaciones 5 a 9 y caracterizado por comprender: a) una retrotranscriptasa, y b) al menos, un elemento de la lista que comprende:

i) un tampón, ii) un cebador, ííi) una AON polimerasa dependiente de ADN , y iv) un nucleótido.

16. Kit pronóstico de nefritis o nefritis lúpica caracterizado por ser útil para la realización del

método según las reivindicaciones 10 a 13 y caracterizado por comprender: a) un anticuerpo monoclonal anti-NRP1 , b) un anticuerpo policlonal anti-NRP-1 , preferiblemente conjugado con biotina,

c) un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina, y d) un sustrato cromogénico.

17. Método según las reivindicaciones 3 a 14 o kit según las reivindicaciones 15 a 16 caracterizado por que la muestra es orina.

18. Uso del método según las reivindicaciones 3 a 14 o del kit según las reivindicaciones 15 a 16 para evaluar el desarrollo en pacientes urológicos de nefritis o de nefritis lúpica.

19. Uso del método según las reivindicaciones 3 a 14 o kit según las reivindicaciones 15 a 15 16 para evaluar el efecto de un fármaco o candidato a fármaco en pacientes urológicos con nefritis o nefritis lúpica.