Sacáridos Vi conjugados.

Un procedimiento de producción de un conjugado de Vi que comprende las etapas de:

a) combinación simultánea de un ácido adípico y conector de dihidrazida, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) y una proteína vehículo;

b) eliminación de cualquier conector en exceso del producto de la etapa a);

c) hacer reaccionar Vi con EDAC a una relación molar de Vi:EDAC de ≥ 5:1; y

d) hacer reaccionar el producto de la etapa b) con el producto de la etapa c).

Sacáridos Vi conjugados

Campo técnico

La invención se refiere a vacunas, de forma más particular aquellas contra fiebre tifoidea.

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Técnica anterior 5

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La fiebre tifoidea es una enfermedad seria común en muchas partes del mundo. Se usa polisacárido capsular purificado de Salmonella Typhi (Vi) como una vacuna, proporcionando aproximadamente 70% de protección frente a fiebre tifoidea en individuos de 5 a 45 años de edad. Sin embargo la vacuna es incapaz de establecer memoria inmunológica y no es eficaz en bebés y niños [1]. Una vacuna conjugada de Vi acoplada con exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa mutante recombinante (Vi-rEPA) dio una respuesta de refuerzo en chicos jóvenes y era 10 muy eficaz [2].

El documento WO 02/20059 A2 describe un procedimiento para la producción de un conjugado de polisacárido capsular purificado de salmonella typhi, en el que se combina simultáneamente una fracción purificada de la proteína vehículo albúmina de suero de pollo con la carbodiimida EDC y el conector ADH, seguido de eliminación del conector en exceso mediante diálisis. 15

Lillo (2003) Carbohydrate Polymers 51 (3) :317-325 describe que la oxidación de poli--D-falactosamina con óxidos de nitrógeno da un derivado que es similar al polisacárido Vi antigénico de Salmonella typhi.

Es un objeto de la invención proporcionar nuevos procedimientos para la producción de vacunas de conjugado de Vi que se puedan usar a una escala industrial.

Descripción de la invención 20

Los inventores ha dilucidado un nuevo procedimiento para la producción de conjugados de Vi y por tanto han producido un nuevo conjugado que comprende Vi acoplado con CRM197 de acuerdo con las reivindicaciones.

Un primer aspecto de la descripción proporciona un procedimiento para la preparación de un conjugado de Vi. Se añaden un conector, tal como una dihidrazida de ácido adípico (ADH) , y una carbodiimida, tal como 1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC) simultáneamente a una solución que contiene una proteína vehículo tal 25 como CRM197 o toxoide de tétanos (TT) , dando una proteína vehículo derivatizada.

Se puede añadir un tampón, tal como ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES) a la solución que contiene la proteína vehículo antes de la adición del ADH y EDAC. La relación en peso de la carbodiimida a la proteína es de forma típica de 0, 1 a 0, 15, ya que mayores relaciones de carbodiimida/proteína pueden provocar la formación de agregados. 30

Tras la derivatización de la proteína vehículo se elimina cualquier conector en exceso (por ejemplo, ADH) , por ejemplo, mediante diálisis o filtración de flujo tangencial (TFF) .

Vi es activado también con una carbodiimida y se combina subsiguientemente con la proteína vehículo derivatizada. Para la activación de Vi se pueden usar diversas relaciones de Vi a carbodiimida. Se puede usar una relación molar 1:1 (grupos COOH de Vi a carbodiimida) , pero no se reduce la cantidad de derivados de carbodiimida no conjugada 35 residual (por ejemplo, ureas tales como EDU; se pueden usar mayores ratios de N-etil-N- (3-dimetilaminopropil) urea, un producto de reacción soluble de acoplamiento de EDAC) es decir con un exceso molar de Vi por ejemplo > 1, 5:1 y de forma ideal 3:1, tales como 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 o superiores. Se podría usar relaciones hasta de 200:1. Estas relaciones son mayores que los usadas en la referencia 3. La activación de Vi se puede llevar a cabo a temperatura ambiente por ejemplo en aproximadamente 2 minutos. 40

Por tanto el procedimiento comprende las etapas de:

a) Combinación simultánea de un conector, una carbodiimida y una proteína vehículo.

b) Hacer reaccionar Vi con una carbodiimida

c) Hacer reaccionar el producto de la etapa a) con el producto de la etapa b) .

Las etapas a) y b) se pueden llevar a cabo en cualquier orden. 45

Tras la etapa a) , pero antes de la etapa c) , se puede eliminar cualquier conector en exceso.

Este aspecto de la descripción también proporciona un procedimiento para la preparación de un conjugado de Vi-CRM197, en el que Vi se combina con CRM197 derivatizado. El procedimiento comprende las etapas de:

a) Hacer reaccionar Vi con una carbodiimida

b) Hacer reaccionar el producto de la etapa a) con CRM197 derivatizado.

Este aspecto de la descripción proporciona también un procedimiento para la preparación de un conjugado de Vi-CRM197, que comprende la etapa de:

a) Hacer reaccionar Vi activado con CRM197 derivatizado 5

La referencia 3 describe un procedimiento para la preparación de conjugados de Vi con rEPA y albúmina de suero bovino (BSA) mediante síntesis mediada con carbodiimida con ADH como el conector. Sin embargo, este procedimiento no implica la combinación simultánea de rEPA/BSA, ADH y EDAC. Más bien rEPA/BSA y ADH se combinan y mezclan antes de la adición de ENAC.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un conjugado de Vi-CRM197. Este conjugado se puede preparar 10 mediante el procedimiento anterior, o se puede obtener por otros medios.

Sacárido Vi Vi es el sacárido capsular de Salmonella typhi (clasificado previamente como una especie en sí, pero ahora denominado como la typhi serovar de S. enterica) . Vi puede también encontrarse en otros serovares de Salmonella (tal como serovar paratyphi C de S. entérica o serovar dublin) y en otras bacterias, tales como Citrobacter (por 15 ejemplo C.freundii y C.youngae) . El polisacárido Vi es un homopolímero lineal de un ácido hexosaminurónico, ácido 1, 4-N-acetilgalactosaminourónico, que está acetilado al 60 - 90% en la posición C-3 [4-9]. La sustitución de O-acetilo en Vi es un factor en su capacidad para dar una respuesta inmunoprotectora [10]. La inmunogenicidad de Vi está estrechamente relacionada con su grado de O-acetilación. La des-O-acetilación parcial puede aumentar ligeramente la inmunogenicidad; la des-O-acetilación completa elimina la inmunogenicidad de Vi [11]. 20

El sacárido Vi usado en la presente invención se puede modificar químicamente respecto al sacárido capsular que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el sacárido Vi puede estar parcialmente des-O-acetilado, des-N-acetilado (parcial o completamente) , N-propionado (parcial o completamente) , etc. La des-acetilación puede tener lugar antes, durante o tras conjugación, pero preferiblemente tiene lugar antes de la conjugación. El efecto de des-acetilación etc. se puede evaluar por ensayo rutinario. 25

El sacárido Vi se puede hidrolizar para formar polisacáridos acortados (por ejemplo, con un grado de polimerización (DP) de al menos 10, por ejemplo, 20, 30, 40, 50, 60 ó más) u oligosacáridos (por ejemplo, con un grao de polimerización de 2 a 10) . Se prefieren oligosacáridos a polisacáridos para uso en vacunas. El grado medio de polimerización se puede medir de forma conveniente mediante cromatografía de intercambio de iones o por ensayo colorimétrico [12]. 30

Además se ha encontrado por inmunodifusión doble que pectina, cuando está O-acetilada en C-2 y C-3, es antigénicamente idéntica a Vi. La estructura de Vi difiere de la de la pectina en que está N-acetilada en C-2 y O-acetilada en C-3. La pectina O-acetilada conjugada con toxoide de tétanos da anticuerpos de Vi en ratones, y la reinyección da una respuesta de refuerzo [13, 14]. De acuerdo con lo anterior la pectina O-acetilada se puede usar en la invención en lugar de Vi. Sin embargo los conjugados Vi se han evidenciado que son significativamente más 35 inmunogénicos que sus análogos de pectina O-acetilada, y de este modo Vi se prefiere de fuentes naturales [13]. No obstante, se entenderá que referencias a "Vi" puede incluir "pectina O-acetilada" y cualesquiera otras moléculas que pueden ser estructuralmente o antigénicamente idénticas a Vi y son capaces de dar anticuerpos que reconocen Vi nativo.

"Vi" puede referirse a un polisacárido Vi (por ejemplo, con un grado de polimerización de al menos 10, por ejemplo 40 20, 30, 40, 50, 60 o más) o un oligosacárido Vi (por ejemplo, con un grado de polimerización de 2 a 10) y puede haber sido modificado químicamente. Los oligosacáridos pueden ser el resultado de la despolimerización y/o hidrólisis de un polisacárido padre.

Purificación de Vi

Se pueden purificar sacáridos capsulares mediante técnicas conocidas, como se describe en las referencias de esta 45 invención. Un procedimiento típico implica la extracción con base, centrifugación,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de un conjugado de Vi que comprende las etapas de:

a) combinación simultánea de un ácido adípico y conector de dihidrazida, 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC) y una proteína vehículo;

b) eliminación de cualquier conector en exceso del producto de la etapa a) ; 5

c) hacer reaccionar Vi con EDAC a una relación molar de Vi:EDAC de 5:1; y d) hacer reaccionar el producto de la etapa b) con el producto de la etapa c) .

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la relación molar Vi:EDAC es 9:1.

3. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el conector en exceso se elimina por diálisis.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína vehículo es bien CRM 197 o bien toxoide de tétanos.

5. Un conjugado que se puede obtener con un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente. 15

6. Un conjugado que comprende Vi unido a CRM197.

7. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 6, en la que el Vi se une al CRM 197 mediante un conector de dihidrazida de ácido adípico (ADH) .

8. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 20

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la composición no está coadyuvada o en la que la composición comprende además un adyuvante.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 o reivindicación 9, que comprende solución salina.

11. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que una dosis unidad de la composición incluye 5 g de sacárido Vi. 25

12. Un conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para uso en un procedimiento para el aumento de una respuesta inmune en un mamífero, comprendiendo el procedimiento la administración del conjugado al mamífero.

13. Una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para uso en un procedimiento para aumento de una respuesta inmune en un mamífero, comprendiendo el procedimiento la administración de la composición farmacéutica al mamífero. 30