Anticuerpos contra IL-25.

Un miembro de unión a diana que se une a IL-25, que comprende un dominio VL de anticuerpo que comprende las CDR 1-3 de Kabat como se expone como los restos 24-34 (SEC ID Nº:

29); 50-56 (SEC ID Nº: 30) y 89-97 (SEC ID Nº: 31), respectivamente, de SEC ID Nº: 15 y un dominio VH de anticuerpo que comprende SEC ID Nº: 1: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser en donde:

Xa1 es Ser o Thr;

Xa2 es Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr o Met;

Xa3 es Met o Ile;

Xa4 es Val o Arg; y

Xa5 es Asp, Asn o Gly.

Anticuerpos contra IL-25 Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos, que incluyen fragmentos de unión de los mismos, dirigidos a interleucina 25 (IL-25).

Antecedentes de la invención

Asma

El asma es un trastorno inflamatorio crónico común de las vías respiratorias. El número de pacientes ha aumentado espectacularmente durante las últimas décadas y la Organización Mundial de la Salud estima que del orden de 3 millones de personas en el mundo padecen asma. El asma alérgica se caracteriza por hipersensibilidad de las vías respiratorias (HVR) incontrolable inducida por varios estímulos provocativos y está asociada a infiltrados inflamatorios del tipo 2 en los pulmones.

Las citocinas de tipo 2 desempeñan una función importante en mediar en la inmunidad protectora a infección parasítica por helmintos, regular funciones efectoras tales como el crecimiento de linfocitos B y secreción de IgE, inducir hiperplasia de células caliciformes y producción de moco asociada, eosinofilia, mastocitosis y fibrosis (/). Es las principales funciones desempeñadas por estas citocinas en la regulación de estas funciones efectoras las que las han hecho dianas terapéuticas clave en el asma. De hecho, los modelos de ratón en los que estas citocinas se expresan en exceso muestran características significativas del asma. Sorprendentemente entonces, los esfuerzos para mejorar el asma experimental bloqueando citocinas de tipo 2 específicas han demostrado ser insatisfactorios, con la excepción de inhibir IL-13.

La inhibición de IL-13 suprime tanto HVR como la inflamación de las vías respiratorias, aunque el mecanismo sigue sin estar claro (2, 3). Sin embargo, dada la compleja patofisiología y la poco entendida etiología del asma, es incierto si las rutas individuales que eligen diana demostrarán por último lugar ser terapéuticamente satisfactorias.

Recientemente, se ha mostrado que la expresión en exceso de IL-25/IL-17E, un miembro de la familia de citocinas IL-17 estructuralmente relacionada (8), induce respuesta de tipo 2 in vivo {4-6) y aumenta la sensibilidad a los agonistas de las vías respiratorias (7). Ratones 1125*' dejaron de expulsar parásitos helmínticos eficazmente; un indicador clave de una respuesta de tipo 2 inefectiva (9, 1). También se ha mostrado que IL-25 se regula por incremento en muestras de pacientes con asma.

Enfermedad inflamatoria del intestino

La enfermedad inflamatoria del intestino (Eli) es una inflamación crónica que afecta la capa mucosa del intestino grueso o colon, que normalmente comprende una o más condiciones de enfermedad seleccionadas del grupo que consiste en colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC). Se cree que la CU es una enfermedad mediada por Th2, mostrando un modelo de ratón representativo la participación de citocinas de tipo 2 en el desarrollo de inflamación del intestino (16). Se ha observado producción de IL-25 en un modelo de ratón de colitis crónica, en asociación con un cambio de respuesta de tipo Th1 a Th2 (17) y se ha informado de alta expresión de ARNm de IL- 25 a lo largo del tubo gastrointestinal en ratones (18). Además, el gen IL-25 está localizado dentro de una región de susceptibilidad a enfermedad de Crohn en el cromosoma 14, aunque queda por investigar su posible asociación con la enfermedad (19). Además, la Eli puede comprender una o más condiciones de enfermedad seleccionadas del grupo que consiste en colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por desviación, síndrome de Behget, colitis infecciosa y colitis indeterminada.

Las terapias convencionales para el tratamiento de Eli implican tanto antibióticos como fármacos derivados de esteroides; sin embargo, estos no son actualmente satisfactorios en inducir o mantener la remisión clínica en pacientes (2). También está actualmente disponible una terapia que implica agentes anti-TNF-a, a pesar de que muestra mala eficacia (21, 22). Esto muestra que hay una clara necesidad de terapias nuevas y más eficaces en el tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino.

Anticuerpos

La estructura básica de un anticuerpo es muy conocida en la técnica. Un anticuerpo que se produce naturalmente normalmente tiene cuatro cadenas de polipéptidos: dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas conectadas por enlaces disulfuro. Las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) tienen cada una una región constante y una región variable (o dominio). Las regiones variables son principalmente responsables de la unión al antígeno. Dentro de cada región variable, tres subregiones, conocidas como las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), hacen contacto con el antígeno. Las CDR de cada dominio variable se numeran, del

extremo N al extremo C, CDR1, CDR2 y CDR3. Entre el extremo N y C de las CDR están las cuatro denominadas regiones estructurales, que hacen algunos contactos, si los hacen, con el antígeno. Más detalles referentes a las estructuras de anticuerpos se ilustran en muchos de los documentos citados más adelante, que se incorporan en el presente documento por referencia.

Hay varias formas en las que pueden producirse los anticuerpos contra un antígeno diana. La generación de anticuerpos monoclonales usando tecnología de hibridomas es un método tal. Los anticuerpos se generan normalmente en ratones u otros roedores. Esto puede ser una forma útil de generar anticuerpos de alta afinidad. Sin embargo, para que tales anticuerpos sean entonces útiles en terapia humana, es normalmente necesario transferir las CDR de los anticuerpos a una región estructural humana. Es decir, intentar evitar una respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón en un paciente.

El principio general del injerto de CDR lo describieron Jones et al. y Riechman et al. (11, 12). Es decir, las CDR de un anticuerpo de ratón se trasplantan en las regiones estructurales de un anticuerpo humano receptor. En la práctica, aunque el anticuerpo resultante se unirá al mismo antígeno diana que el anticuerpo de ratón donante original, la afinidad del anticuerpo injertado es normalmente muy reducida.

Además, la termoestabilidad de los anticuerpos injertados puede comprometerse frecuentemente.

Se conocen en la técnica diversas formas para intentar recuperar y optimizar las propiedades del anticuerpo original. Por ejemplo, dentro de las regiones estructurales hay ciertos restos "de estructura canónica" Chotia & Lesk (13) que están asociados a ciertas CDR de la línea germinal. Además, Foote & Winter (14) han identificado restos de "zona Vernier" (algunos de los cuales también son restos de estructura canónica) que soportan las conformaciones de bucle de unión al antígeno y sus disposiciones relativas y, por tanto, se ha sugerido que desempeñan una función importante en sintonizar el ajuste de un anticuerpo al antígeno. Además, se cree que restos adicionales dentro de la región estructural estabilizan y mantienen la superficie de separación de VH/VL. Por consiguiente, aquellos expertos en la materia que buscan humanizar un anticuerpo frecuentemente buscan regiones estructurales humanas en las que los restos de la zona de Vernier, canónicos y de la superficie de separación ("VCI") se correspondan tan estrechamente como sea posible con aquellos del anticuerpo donante original.

Sin embargo, cada anticuerpo representa un desafío único para aquellos expertos en la materia y no hay certeza en que cualquier metodología generalmente conocida para el injerto de CDR sea directamente aplicable en cada caso.

Los presentes inventores y colaboradores (Ballantyne et al. (15)) informan de la producción de un anticuerpo monoclonal de ratón, 2C3, que se une a IL-25 e in vivo puede bloquear la hipersensibilidad de las vías respiratorias en asma alérgica. Hasta la fecha, la secuencia del anticuerpo no ha estado disponible para el público.

El documento PCT/GB28/1365, publicado el 3 de octubre de 28 como el documento W28/129263, informa de la secuencia del anticuerpo 2C3 y su uso en bloquear la hipersensibilidad de las vías respiratorias.

Divulgación de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado (injertado con CDR) que se basa en la secuencia de 2C3. En la producción de este anticuerpo tuvieron que superarse varios retos.

Los inventores seleccionaron en primer lugar una cadena de VH de anticuerpo humano receptor con homología máxima por VCI, concretamente 2 de los 22 restos de VCI. Sin embargo, se encontró que el anticuerpo resultante ("RHA") se unió a IL-25 a un grado significativamente menor que el propio 2C3. A pesar de varias modificaciones adicionales al anticuerpo, que incluyen cambios a los aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Un miembro de unión a diana que se une a IL-25, que comprende un dominio VL de anticuerpo que comprende las CDR 1-3 de Kabat como se expone como los restos 24-34 (SEC ID N2: 29); 5-56 (SEC ID N2: 3) y 89-97 (SEC ID N2: 31), respectivamente, de SEC ID N2:15 y un dominio VH de anticuerpo que comprende SEC ID N2:1:

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser en donde:

Xa1 es Ser o Thr;

Xa2 es Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr o Met;

Xa3 es Met o lie;

Xa4 es Val o Arg; y Xa5 es Asp, Asn o Gly.

2. El miembro de unión a diana de la reivindicación 1, en el que

(a) Xa2 es Gly y Xa5 es Asp o Asn;

(b) Xa2 es Gly y Xa5 es Asp

(c) Xa1 es Ser;

(d) Xa1 es Thr;

(e) Xa3 es Met;

(f) Xa3 es lie;

(g) Xa4 es Val; o

(h) Xa4 es Arg.

3. El miembro de unión a diana de la reivindicación 1, en el que los restos Xa1 - Xa5 están en las siguientes combinaciones:

4. El miembro de unión a diana de la reivindicación 1:

(a) en el que el dominio VL incluye adicionalmente los restos 35-38 de SEC ID N2: 15 adyacentes a CDR1 (SEC ID N2: 29);

(b) que comprende SEC ID N2:15;

(c) en el que el dominio VL es humanizado; o

(d) en el que el dominio VL es humanizado, y la secuencia del miembro de unión a diana comprende los aminoácidos 21-127 de SEC ID N2: 25.

5. El miembro de unión a diana de la reivindicación 1, que es un fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2, scFv o Fv.

6. El miembro de unión a diana de la reivindicación 1 que comprende una región constante de anticuerpo.

7. El miembro de unión a diana de la reivindicación 6, en el que la región constante es una región constante de lgG1 o lgG4 humana.

8. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el miembro de unión a diana de la reivindicación 1.

9. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 8 operativamente ligado a un promotor.

1. Una célula huésped que lleva el vector de expresión de la reivindicación 9.

11. Un método de producción de un miembro de unión a diana, comprendiendo el método cultivar células huésped según la reivindicación 1 en condiciones para la producción de dicho miembro de unión a diana, método que comprende opcionalmente además aislar dicho miembro de unión a diana, y opcionalmente comprende además formular el miembro de unión a diana en una composición que incluye al menos un componente adicional.

12. Una composición que comprende el miembro de unión a diana de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, composición que está opcionalmente en forma de un polvo liofilizado.

13. El miembro de unión a diana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento o la prevención de:

(a) asma;

(b) enfermedad inflamatoria del intestino;

(c) colitis ulcerosa; o

(d) enfermedad de Crohn.

14. Un método de producción de un anticuerpo contra IL-25, que comprende:

(a) proporcionar un dominio VH de anticuerpo que comprende SEC ID N2:1:

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Xa1 Xa2 Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Xa3 Gly Leu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Xa4 Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Xa5 Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser en donde:

Xa1 es Ser o Thr;

Xa2 es Gly, Asp, Ala, Ser, Val, Asn, Lys, Tyr o Met;

Xa3 es Met o lie;

Xa4 es Val o Arg; y Xa5 es Asp, Asn o Gly;

(b) combinar dicho dominio VH con una pluralidad de dominios VL de anticuerpo para proporcionar moléculas de anticuerpo;

(c) cribar dichas moléculas de anticuerpo para unirse a IL-25; y

(d) seleccionar una molécula de anticuerpo que se une a IL-25.

15. El miembro de unión a diana de la reivindicación 1, que comprende un anticuerpo completo.