Silenciamiento de genes.

Un constructo de transformación de plantas, que comprende al menos dos copias de un polinucleótido deseado que están orientadas como una repetición invertida y que están enlazadas operativamente a y flanqueadas por elementos reguladores,

en donde el polinucleótido deseado comprende una secuencia del promotor de un gen objetivo pero ninguna secuencia localizada corriente abajo del inicio de la transcripción del gen objetivo y

en donde los elementos reguladores son dos promotores de plantas funcionales orientados para inducir la transcripción convergente de las dos copias del polinucleótido deseado, y

en donde el polinucleótido deseado comparte identidad de secuencia hasta al menos 24 oligonucleótidos contiguos de la secuencia promotora del gen objetivo.

Silenciamiento de genes Campo de la invención

La presente invención se relaciona con constructos únicos para producir un producto de ácido nucleico que subregula o evita la expresión de un polinucleótido objetivo deseado.

Antecedentes de la invención

La supresión de la expresión genética puede ser lograda por constructos que disparan silenciamiento de genes postranscripcional o transcripcional. Estos mecanismos de silenciamiento pueden subregular la expresión de polinucleótidos o genes deseados por modificación de la cromatina, escisión del ARN, represión translacional, o a través de mecanismos hasta ahora desconocidos, véase MeisterG. and Tuschl T., Nature, vol.431, pp. 343-349, 2004.

Un constructo que es típicamente utilizado en este aspecto contiene un polinucleótido deseado, el cual comparte identidad de secuencia con al menos una parte de un gen objetivo que está operablemente enlazado a un promotor y a un termlnador. Como es bien evidente, el promotor Inicia la transcripción, mientras que el terminador termina la transcripción en un sitio específico y subsecuentemente media en la poliadenilación. Tal procesamiento de transcripto es importante para la estabilidad del transcripto y su transporte desde el núcleo y hacia el citoplasma.

En este aspecto, el termlnador juega un papel Importante en los constructos convencionales para silenciamiento de genes. Por ejemplo, la WO 99/53050 describe un constructo que comprende un promotor, un polinucleótido que comprende una primera secuencia con homología a un gen objetivo y una segunda secuencia que es inversa complementarla al gen objetivo, y un terminador. Un termlnador de constructos convencional no necesariamente tiene que estar poslclonado inmediatamente corriente abajo a partir del polinucleótido deseado. Por ejemplo, Mette y colaboradores describen un plásmido que contiene un polinucleótido deseado que está separado de un terminador operativamente enlazado mediante un gen de hlgromlclna (Mette et al., EMBO J 18:241-8, 1999; Mette et al., EMBO J 19: 5194-201,2000).

Otros constructos convencionales diseñados para silenciar genes contienen un polinucleótido en la orientación sentido o antlsentido entre el promotor y el termlnador. Tal constructo silenciador de genes convencional produce típicamente transcriptos de ARN que son similares en tamaño, determinados por la distancia desde el inicio de la transcripción al sitio de escisión de la terminación y la cola polladenilada.

La presente invención se relaciona con nuevas estrategias y constructos para silenciamiento de genes que son en general más efectivas que los constructos convencionales. Adlclonalmente, la presente invención se relaciona con nuevas estrategias y constructos para el silenciamiento de genes utilizando un polinucleótido que no está enlazado operativamente a un promotor y un terminador pero que en vez de esto está enlazado operativamente a dos promotores orientados convergentemente.

Resumen de la invención

Estrategias y constructos pueden ser caracterizados por ciertas características. Un constructo, por ejemplo, puede no comprender una región de ADN, tal como un terminador, que está involucrado en la formación del extremo 3' y la poliadenilación. Alternativamente, el constructo puede comprender un terminador no funcional que es de manera natural no funcional o que ha sido modificado o mutado para hacerse no funcional.

Un constructo puede ser caracterizado también por la disposición de promotores a cada lado del polinucleótido deseado. Por lo tanto, un constructo puede comprender dos o más promotores que flanquean uno o más polinucleótidos deseados o que flanquea copias de un polinucleótido deseado, de tal manera que se transcriben ambas cadenas del polinucleótido deseado. Esto es un promotor puede estar orientado para iniciar la transcripción del extremo 5' de un polinucleótido deseado, mientras que un segundo promotor puede estar orientado operativamente para iniciar la transcripción desde el extremo 3' del mismo polinucleótido deseado. Los promotores orientados opuestamente pueden flanquear copias múltiples del polinucleótido deseado. Por lo tanto, el "número de coplas" puede variar de tal manera que un constructo puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100, o más de 100 coplas, o cualquier entero intermedio, de un polinucleótido deseado finalmente flanqueado por promotores que están orientados para inducir la transcripción convergente.

Alternativamente, un primer promotor puede estar enlazado operativamente a un primer polinucleótido en el "casete A", por ejemplo, y un segundo promotor puede estar enlazado operativamente a un segundo polinucleótido, por ejemplo, "casete B". Los polinucleótidos de cada casete pueden o pueden no comprender la misma secuencia de nucleótidos, pero pueden compartir algún porcentaje de identidad de secuencia con un ácido nucleico objetivo de interés. Los casetes pueden ser dispuestos aleatoriamente, esto es, de tal forma que son adyacentes uno a otro en el constructo. Adicionalmente, el casete B, por ejemplo, puede estar orientado en la orientación complementaria inversa al casete A.

En esta disposición, por lo tanto, la transcripción a partir del promotor del casete B procederá en la dirección hacia el promotor del casete A. Por lo tanto, los casetes están dispuestos para inducir "transcripción convergente".

Si ningún casete comprende una secuencia de terminador, entonces tal constructo, en virtud de la disposición de transcripción convergente, puede producir transcriptos de ARN que son de longitudes diferentes.

En esta situación, por lo tanto, pueden existir subpoblaciones de transcriptos de ARN parcial o completamente transcritas que comprenden secuencias de longitud parcial o completa del polinucleótido transcrito deseado a partir del casete respectivo. Alternativamente, en la ausencia de un terminador funcional, la maquinaria de transcripción puede proceder después del final de un polinucleótido deseado para producir un transcripto que es más largo que la longitud del polinucleótido deseado.

En un constructo que comprende dos copias de un polinucleótido deseado, por lo tanto, donde uno de los polinucleótidos puede o puede no estar orientado en la dirección complementaria inversa al otro, y donde los polinucleótidos están enlazados operativamente a promotores para inducir la transcripción convergente, y no hay un terminador funcional en el constructo, la maquinaria de transcripción que se inicia desde un polinucleótido deseado puede proceder a transcribir la otra copia del polinucleótido deseado y viceversa. Las copias múltiples del polinucleótido deseado pueden estar orientadas en diversas permutaciones: en el caso donde dos copias del polinucleótido deseado están presentes en el constructo, las copias pueden, por ejemplo, estar orientadas en la misma dirección, en la orientación inversa una a otra, o en la orientación complementaria inversa una a otra, por ejemplo.

En una disposición en donde uno de los polinucleótidos deseados está orientado en la orientación complementaria inversa del otro polinucleótido, puede ser producido un transcripto de ARN que comprende no solamente la secuencia "en sentido" del primer polinucleótido sino también la secuencia "antisentido" del segundo polinucleótido. Si el primero y segundo polinucleótidos comprende las mismas o sustancialmente las mismas secuencias de ADN, entonces el transcripto de ARN individual puede comprender dos regiones que son complementarias una a otra y que pueden, por lo tanto, fusionarse. Por lo tanto, el transcripto de ARN individual que es transcripto de esta manera, puede formar una estructura dúplex de horquilla parcial o completa.

Por otro lado, si se produjeran dos copias de tal transcripto largo, una de cada promotor, entonces existirían dos moléculas de ARN, cada una de las cuales compartiría regiones de complementariedad de secuencias con la otra. Por lo tanto, la región "en sentido" del primer transcripto de ARN puede fusionarse a la región "antisentido" del segundo transcripto de ARN y viceversa. En esta disposición, por lo tanto, puede formarse otro dúplex de ARN el cual consiste de dos transcriptos de ARN separados, en oposición a un dúplex en horquilla que se forma a partir de un transcripto de ARN individual autocomplementarlo.

Alternativamente, dos copias del polinucleótido deseado pueden estar orientadas en la misma dirección de tal manera que, en el caso de lectura a través de la transcripción, el transcripto de ARN largo que es producido a partir de un promotor puede comprender, por ejemplo, la secuencia en sentido de la primera copia del polinucleótido deseado y también la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Un constructo de transformación de plantas, que comprende al menos dos copias de un polinucleótido deseado que están orientadas como una repetición invertida y que están enlazadas operativamente a y flanqueadas por elementos reguladores, en donde el polinucleótido deseado comprende una secuencia del promotor de un gen objetivo pero ninguna secuencia localizada corriente abajo del inicio de la transcripción del gen objetivo y

en donde los elementos reguladores son dos promotores de plantas funcionales orientados para inducir la transcripción convergente de las dos coplas del polinucleótido deseado, y

en donde el polinucleótido deseado comparte identidad de secuencia hasta al menos 24 oligonucleótidos contiguos de la secuencia promotora del gen objetivo.

2. El constructo de transformación de planta de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un espaciador posicionado entre las dos coplas del polinucleótido deseado.

3. El constructo de transformación de planta de la reivindicación 1 o 2, en donde el promotor de planta funcional es un promotor específico de tejido.

4. El constructo de transformación de planta de la reivindicación 3, en donde el promotor de planta funcional es específico para un tejido de planta seleccionado de un tubérculo, una semilla, una fruta, una hoja, una raíz, un sistema vascular, una flor, polen y un óvulo.

5. El constructo de transformación de planta de la reivindicación 3 o 4, en donde el promotor funcional específico de tejido es seleccionado de un promotor de sintasa de almidón de enlazamiento de gránulos y un promotor de ADP glucosa pirofosforilasa.

6. El constructo de transformación de planta de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el gen objetivo es seleccionado de un gen COMT involucrado en la biosíntesis de la lignina, un gen CCOMT involucrado en la biosíntesis de la lignina, cualquier otro gen involucrado en la biosíntesis de la lignina, un gen R1 involucrado en la fosforilación de almidón, un gen fosforilasa-L involucrado en la fosforilación del almidón, un gen PPO involucrado en la oxidación de polifenoles, un gen de poligalacturonasa involucrada en la degradación de la pectina, un gen involucrado en la producción de alérgenos, y un gen involucrado en la biosíntesis de ácidos grasos.

7. El constructo de transformación de planta de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el gen objetivo es PPO.

8. El constructo de transformación de planta de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el gen objetivo es R1.

9. El constructo de transformación de planta de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polinucleótido deseado comprende secuencias promotoras de múltiples genes objetivo.

10. El constructo de transformación de plantas de la reivindicación 9, en donde el polinucleótido deseado produce un transcripto que direccione y reduce la expresión de un gen objetivo de polifenol oxidasa, un gen objetivo de fosforilasa L y un gen objetivo R1.

11. Un método para reducir la expresión de un gen objetivo en una célula vegetal, que comprende expresar el constructo de transformación de planta como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en una célula vegetal, en donde el nivel de expresión del gen objetivo es reducido en comparación con el nivel de expresión del gen objetivo en una célula vegetal no transformada.

12. El método de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente obtener una planta a partir de la célula vegetal que expresa el constructo de transformación de planta.