Polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa I y polinucleótidos que codifican los mismos.

Polipéptido con actividad de celobiohidrolasa I, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con los aminoácidos 1 a 529 de SEC ID nº 4, y

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con el polipéptido codificado por los nucleótidos 1 a 1.587 de SEC ID nº 3.

Polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa I y polinucleótidos que codifican los mismos Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad de celobiohidrolasa I (también llamada CBH I o CBH 1) y polinucleótidos con una secuencia nucleótida que codifica para los polipéptidos. La invención también se refiere a vectores y células huésped que incluyen constructos de ácidos nucleicos al igual que métodos para producir y usar los polipéptidos.

Antecedentes de la Invención

[0002] Celulosa es una materia prima industrial importante y una fuente de energía renovable. La estructura física y la morfología de celulosa nativa son complejas y los detalles finos de su estructura han sido difíciles de determinar experimentalmente. No obstante, la composición química de la celulosa es simple, consiste en residuos de D-glucosa enlazados por enlaces beta-1,4-glicosídicos para formar polímeros lineales con longitud de cadenas de más de 10.000 residuos glicosídicos.

[0003] Para ser eficaz, la digestión de celulosa requiere diferentes tipos de enzimas que actúan cooperativamente. Al menos tres categorías de enzimas son necesarias para convertir celulosa en glucosa: endo (1,4)-beta-D-glucanasas (EC 3,2,1,4) que cortan al azar las cadenas de celulosa; celobiohidrolasas (EC 3,2,1,91) que disocian unidades de celobiosil de las extremidades de cadena de celulosa y beta-glucosldasas (EC 3,2,1,21) que convierten celobiosa y celodextrinas solubles en glucosa. Entre estas tres categorías de enzimas implicadas en la biodegradación de celulosa, celobiohidrolasas son las enzimas clave para la degradación de celulosa cristalina nativa.

[0004] Exo-celobiohidrolasas (celobiohidrolasa i o CBH I) se refieren a las celobiohidrolasas que degradan celulosa mediante hidrolización de la celobiosa del extremo no-reducido de las cadenas de polímero de celulosa.

[0005] de Oliviera Alzevedo et al han divulgado un polipéptido de gen CBH-1 de Humicola grísea var. termoidea en Nucleic Acids Res. 1990, 1990, 18:668-668 (SWISSPROT: P15828, EBI: X17258), que tiene un 81,3 % de identidad con la SEC ID N° 4. Kvachadze et al han publicado el efecto del tratamiento de una cepa de Chaetomium thermophile con luz uv y etilenimina en Mikrobiologiya. 1997, 66(5):644-649. Ramesh et al. describen en Biochimica, Biophysica Acta 1989, 993: 266-274 la purificación y caracterización de dos celobiohidrolasas a partir de Chaetomium thermophile var.coprophile.

[0006] Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos mejorados con actividad de celobiohidrolasa I y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos. Los polipéptidos mejorados pueden tener actividad específica mejorada y/o estabilidad mejorada, en particular termoestabilidad mejorada. Los polipéptidos pueden también tener una capacidad mejorada para resistir inhibición por celobiosa.

Resumen de la invención

[0007] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido con actividad de celobiohidrolasa I, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene como mínimo 95% de identidad con aminoácidos 1 a 529 de SEC ID n° 4, y

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con el polipéptido codificado por nucleótidos 1 a 1578 de SEC ID n° 3,

[0008] En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de la invención.

[0009] En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos, que codifica para el polipéptido de la Invención, operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

[0010] En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención.

[0011] En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recomblnante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención.

[0012] En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de la invención, el método incluye:

(a) cultivo de una célula huésped recombinante de la invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b) recuperación el polipéptido.

[0013] En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un método para producción in situ de un polipéptido de la invención, el método incluye:

(a) cultivo de una célula huésped recombinante de la invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b) contacto del polipéptido con un sustrato deseado sin recuperación previa del polipéptido.

Definiciones

[0014] Antes de discutir la presente invención en detalles adicionales, los siguientes términos y convenios serán definidos primeramente:

Polipéptido substancialmente puro: en el presente contexto, el término "polipéptido substancialmente puro" significa una preparación de polipéptido que contiene como mucho 10% en peso de otro material polipéptido con el cual es originalmente asociado (porcentajes inferiores de otro material polipéptido son preferidos, por ejemplo como mucho 8% en peso, como mucho 6% en peso, como mucho 5% en peso, como mucho 4%, como mucho 3% en peso, como mucho 2% en peso, como mucho 1% en peso y como mucho 14% en peso). Así, se prefiere que el polipéptido substancialmente puro sea al menos 92% puro, es decir que el polipéptido constituya al menos 92% en peso del material polipéptido total presente en la preparación, y porcentajes más altos son preferidos tal como al menos 94% puro, al menos 95% puro, al menos 96% puro, al menos 96% puro, al menos 97% puro, al menos 98% puro, al menos 99% y como mucho 99.5% puro. Los polipéptidos descritos aquí están preferiblemente en una forma substancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos descritos aquí estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polipéptido esté esencialmente libre de otro material polipéptido con el cual es originalmente asociado. Esto puede ser realizado, por ejemplo, por preparación del polipéptido mediante bien conocidos métodos recombinantes. Aquí, el término "polipéptido substancialmente puro" es sinónimo de los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada".

[0015] Actividad de celobiohidrolasa I: el término "actividad de celobiohidrolasa I" es definido aquí como una actividad de celulosa 1,4-beta-celobiosidasa (también llamada exo-glucanasa, exo-celobiohidrolasa o 1,4-beta-celobiohidrolasa), como se define en la clase enzimática EC 3.2.1.91, que cataliza la hidrólisis de enlaces de 1,4-beta-D-glucosídlco en celulosa y celotetraosa, liberando celobiosa de las extremidades no-reducidas de las cadenas.

[0016] Para fines de la presente invención, actividad de celobiohidrolasa I puede ser determinada según al procedimiento descrito en el ejemplo 2.

[0017] En una forma de realización, actividad de celobiohidrolasa I puede ser determinada según el procedimiento descrito en Deshpande MV et al., Methods in Enzymology, pp. 126-130 (1988): "Selective Assay for Exo-1,4-Beta- Glucanases". Según este procedimiento, una unidad de actividad de celobiohidrolasa I (actividad de escisión de enlace aglucónico) es definida como 1,0 pmol de p-nitrofenol producido por minuto a 50°C, pH 5,0.

[0018] Los polipéptidos de la presente invención deberían preferiblemente tener al menos 20% de la actividad de celobiohidrolasa I de un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en SEC ID n° 4. En una forma de realización particular preferida, los polipéptidos deberían tener al menos 40%, tal como al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, tal como al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, tal como al menos 90%, muchos preferiblemente al menos 95%, tal como al rededor de o al menos 100% de la actividad de celobiohidrolasa I del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionados de los aminoácidos 1 a 526 de SEC ID n° 4.

[0019] Identidad: en el presente contexto, la homología entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos es descrita por el parámetro "identidad".

[0020] Para fines de la presente Invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos es determinado usando el programa FASTA Incluido en... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido con actividad de celobiohidrolasa I, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con los aminoácidos 1 a 529 de SEC ID n° 4, y

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con el polipéptido codificado por los nucleótidos 1 a 1.587 de SEC ID n° 3.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% con los aminoácidos 1 a 529 de SEC ID n° 4.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que consiste en los aminoácidos 1 a 529 de SEC ID n° 4.

4. Polinucleótido con una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 4, ligada de forma operativa a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

6. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 5.

7. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 5.

8. Método para la producción de un polipéptido como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el método comprendiendo:

(a) cultivar una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 8 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b) recuperar el polipéptido.

9. Método para la producción in situ de un polipéptido como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el método comprendiendo:

(a) cultivar una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 8 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y

(b) contactar el polipéptido con un sustrato deseado sin recuperación previa del polipéptido.

10. Método para la producción de etanol de biomasa, que incluye contacto de la biomasa con el polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

11. Uso del polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para producir etanol.

12. Una planta transgénica, parte de planta o célula vegetal, que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa I tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la secuencia de nucleótidos está presente en un vector de expresión que permite integración estable del vector en el genoma de la célula huésped.

13. Composición detergente que comprende un tensioactivo y el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1- 3.