Biosensor.

Biosensor, que comprende una placa base de aislamiento, un sistema de electrodos que contiene por lo menos un electrodo de trabajo y un contraelectrodo y está formado sobre la placa base de aislamiento,

y una sección de suministro de muestras formada sobre el sistema de electrodos,

en el que la sección de suministro de muestras tiene una capa de reacción que comprende:

una primera capa de reacción formada sobre el sistema de electrodos y que contiene por lo menos una enzima redox en la que está incorporada pirroloquinolina quinona (PQQ), dinucleótido de flavina, adenina (FAD) o mononucleótido de flavina (FMN) como grupo prostético; y

una segunda capa de reacción formada aplicando, sobre la primera capa de reacción, una solución que incluye una enzima de descomposición de lípidos.

Biosensor SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere a un biosensor, en particular, a un biosensor para medir la concentración de grasa neutra. La invención se refiere específicamente a un biosensor que puede determinar la concentración de un componente específico en una muestra específica, tal como una muestra de un organismo vivo, cuantitativa y rápidamente mediante la utilización de una reacción enzimática, en particular, siendo dicho biosensor para medir la concentración de grasa neutra.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

En los últimos años, los biosensores han sido utilizados en el sector de la medicina y otros. Los objetivos a medir mediante los biosensores son diversas sustancias químicas, ejemplos de las cuales incluyen moléculas de bajo peso molecular y de alto peso molecular. Según el objetivo a medir, se ha avanzado en el desarrollo de un biosensor que tiene varias funciones.

Hasta la fecha, son conocidos biosensores que pueden obtener fácilmente una determinación cuantitativa sin diluir o remover un componente (sustrato) específico contenido en una muestra de un organismo vivo, o de un alimento. Se ha propuesto, por ejemplo, un biosensor obtenido mediante: formar un sistema de electrodos que tiene por lo menos un electrodo de trabajo y un contraelectrodo en una placa base de aislamiento; colocar, sobre este sistema de electrodos, una capa de reacción enzimática que contiene una enzima redox y un receptor de electrones, inmovilizados cada uno con un agente de inmovilización tal como un polímero hidrófilo; colocar a continuación una capa filtrante (capa de eliminación de corpúsculos sanguíneos) sobre esta capa de reacción enzimática; y cubrir adicionalmente esta capa filtrante, desde arriba, con una tapa para integrar estos elementos en una unidad.

Mediante dicho biosensor, la concentración de sustrato en una muestra se determina cuantitativamente de la siguiente manera: en primer lugar, se vierte una solución de la muestra, tal como sangre, sobre la capa filtrante, y el filtrado resultante penetra en la capa de reacción enzimática. De este modo, la enzima redox y el receptor de electrones se disuelven en la solución de la muestra, de manera que una reacción enzimática avanza entre el sustrato y la enzima. Mediante esta reacción enzimática, el sustrato se oxida y simultáneamente el receptor de electrones se reduce. Después de la finalización de la reacción enzimática, el receptor de electrones reducido se oxida electroquímicamente. A partir del valor de la corriente de oxidación obtenido en este momento, se puede calcular la concentración del sustrato en la solución de la muestra.

Como un procedimiento para medir la grasa neutra con un biosensor se conoce, por ejemplo, un procedimiento de determinación cuantitativa de la grasa neutra en una muestra, tal como sigue: en primer lugar, la grasa neutra contenida en la solución de la muestra se descompone, por ejemplo, en ácido graso libre y glicerina con lipoproteína lipasa (LPL) . Tal como se muestra en las fórmulas (1) y (2) descritas a continuación, la glicerina generada se puede determinar cuantitativamente, utilizando glicerina quinasa (GK) , y glicerina-3-ácido fosfórico oxidasa (GPO) o glicerina-3-ácido fosfórico deshidrogenasa (GPDH) . En otras palabras, la glicerina se puede determinar cuantitativamente midiendo la disminución en el receptor de electrones en forma oxidada, el aumento en el receptor de electrones en forma reducida, o la cantidad de ácido fosfórico dihidroxiacetona, tal como se muestra en las fórmulas siguientes. En particular, midiendo electroquímicamente la magnitud del aumento del receptor de electrones en forma reducida, se puede determinar cuantitativamente la glicerina.

[Fórmula química 1]

GK Glicerina + ATP â glicerina-3-ácido fosfórico (1)

Glicerina-3-ácido fosfórico + receptor de electrones en forma oxidada GPO/GPDH

â ácido fosfórico dihidroxiacetona + receptor de electrones en forma reducida (2)

Sin embargo, cada una de las tres enzimas, es decir, lipoproteína lipasa (LPL) , glicerina quinasa (GK) y glicerina-3ácido fosfórico oxidasa (GPO) , que se utilizan en la medición de grasa neutra mencionada anteriormente, son costosas.

Para resolver este problema, se da a conocer (bibliografía de patentes 1) un biosensor en el que se utilizan, como enzimas utilizadas en la reacción de descomposición de grasa neutra, dos de la enzima de descomposición de grasa neutra y deshidrogenasa de glicerina (GLDH) , para disminuir los costes de las enzimas. Sin embargo, el biosensor

de la bibliografía de patentes 1 no es suficiente en cuanto a tiempo de medición y a precisión. Por lo tanto, es deseable aumentar la precisión y realizar más rápidamente la medición.

Al mismo tiempo, como un procedimiento que utiliza una única enzima sin el resultado deL oxígeno disuelto, se 5 conoce un procedimiento como el mostrado en la formula (3) descrita a continuación, en el que se utiliza NAD+ deshidrogenasa de glicerina dependiente de glicerina (NAD-GLDH) .

[Fórmula química 2]

NAD-GLDH Glicerina + portador de electrones en forma oxidada â

dihidroxiacetona + portador de electrones en forma reducida (3)

Sin embargo, esta reacción requiere la adición de NAD+, que es costoso.

Como un procedimiento para determinar la glicerina de manera cuantitativa, sencilla y económica, se conoce un procedimiento que utiliza poliol deshidrogenasa en que se incorpora pirroloquinolina quinona como un grupo prostético (PQQ-PDH) . El procedimiento se lleva a cabo de acuerdo con la reacción de la formula (4) descrita a continuación; por lo tanto, el procedimiento tiene ventajas, por ejemplo, porque la determinación no se ve afectada por el oxígeno disuelto, la reacción es simple, es innecesaria la utilización de diversas enzimas, y no se requiere la adición de NAD+ costosa.

[Fórmula química 3] 25 PQQ-PDH Glicerina + portador de electrones en forma oxidada â

dihidroxiacetona + portador de electrones en forma reducida (4)

Considerando las cuestiones anteriores, para proporcionar un biosensor capaz de medir la grasa neutra con gran precisión en poco tiempo, se han realizado hasta la fecha informes sobre biosensores, en cada uno de los cuales están situadas una enzima de descomposición de grasa neutra y deshidrogenasa de glicerina en capas diferentes, respectivamente (bibliografía de patentes 2 y 3) . El biosensor de la bibliografía de patentes 2 posee una estructura que tiene, en un electrodo, una capa polímera que contiene GLDH y un polímero hidrófilo, y una capa filtrante que contiene una enzima de descomposición de grasa neutra soportada en un papel de filtro, estando laminadas a su vez estas dos capas de reacción. El biosensor de la bibliografía de patentes 3 se caracteriza porque posee una estructura que tiene, en un electrodo, una capa polímera que contiene GLDH y un polímero hidrófilo, y una capa de tela no tejida que contiene una enzima de descomposición de grasa neutra soportada en una tela no tejida, estando laminadas a su vez estas dos capas de reacción.

Técnica anterior Bibliografía de patentes 45 Bibliografía de patente 1: folleto WO 2006/104077

Bibliografía de patente 2: solicitud de patente japonesa a inspección pública (JP-A) número 2009-244013.

Bibliografía de patente 3: JP-A-2009-244014.

CARACTERÃ?STICAS DE LA INVENCIÓN

Problema técnico 55 Sin embargo, incluso según los biosensores descritos en la bibliografía de patentes 2 y 3, el tiempo de medición es de dos minutos en el ejemplo (párrafo [0100] de la bibliografía de patentes 2, y párrafo [0100] de la bibliografía de patentes 3) . En conclusión, el tiempo de medición no es aún lo suficientemente corto. Por lo tanto, es deseable un biosensor que pueda realizar la medición en un tiempo más corto.

De este modo, la invención se ha realizado para resolver estos problemas, y un objetivo de la misma es dar a conocer un biosensor que pueda medir la concentración de un componente específico, tal como grasa neutra, en una muestra en un periodo de tiempo corto.

Solución al problema Los inventores han investigado intensamente para resolver los problemas. Como resultado, los inventores han encontrado que cuando se fabrica una capa de reacción en una estructura bicapa, sin utilizar un portador tal como un papel de filtro o una tela no tejida, mediante la formación de una capa que contiene enzimas de descomposición de lípidos sobre una capa que contiene enzimas redox, aplicando una solución que contiene enzimas de descomposición de lípidos directamente sobre la capa que contiene enzimas redox, se pueden mejorar las velocidades... [Seguir leyendo]

1. Biosensor, que comprende una placa base de aislamiento, un sistema de electrodos que contiene por lo menos un electrodo de trabajo y un contraelectrodo y está formado sobre la placa base de aislamiento, y una sección de 5 suministro de muestras formada sobre el sistema de electrodos, en el que la sección de suministro de muestras tiene una capa de reacción que comprende:

una primera capa de reacción formada sobre el sistema de electrodos y que contiene por lo menos una enzima redox en la que está incorporada pirroloquinolina quinona (PQQ) , dinucleótido de flavina, adenina (FAD) o mononucleótido de flavina (FMN) como grupo prostético; y una segunda capa de reacción formada aplicando, sobre la primera capa de reacción, una solución que incluye una enzima de descomposición de lípidos.

2. Biosensor, según la reivindicación 1, en el que la sección de suministro de muestras comprende además un portador de electrones.

3. Biosensor, según la reivindicación 2, en el que el portador de electrones está situado en la segunda capa de 20 reacción, o una tercera capa de reacción que tiene el portador de electrones está dispuesta adicionalmente en la sección de suministro de muestras estando separada de la primera y la segunda capas de reacción.

4. Biosensor, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima redox es poliol deshidrogenasa en la que está incorporada pirroloquinolina quinona (PQQ) como el grupo prostético.

5. Biosensor, según la reivindicación 3 ó 4, en el que la primera, segunda o tercera capas de reacción comprenden además un tensoactivo. 30

6. Biosensor, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la primera, segunda o tercera capas de reacción comprenden además un polímero hidrófilo.

7. Biosensor, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que la primera, segunda o tercera capas de 35 reacción comprenden además por lo menos uno de sacárido y proteína.