EPSPS mutantes.

Un procedimiento de producción de una planta no transgénica, resistente o tolerante a herbicida que comprende:

introducir en células vegetales una oligonucleobase recombinagénica con una mutación dirigida en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen de EPSPS mutante que expresa una proteína EPSPS que está mutada en las posiciones de aminoácidos Thr179 y Pro183 en una proteína EPSPS de Arabidopsis (AF360224) o en un resto de aminoácido análogo en una proteína EPSPS de otra especie en la que Thr179 se cambia a Ile y Pro183 se cambia a Thr; seleccionar una célula vegetal que muestra una tolerancia mejorada al glifosato en comparación con una célula vegetal de tipo silvestre correspondiente; y

regenerar una planta no transgénica resistente o tolerante a herbicida que tiene un gen de EPSPS mutado de dicha célula vegetal seleccionada.

EPSPS mutantes Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de una planta no transgénica resistente o tolerante a un herbicida de la familia de fosfonometilglicina, por ejemplo, glifosato. La presente invención también se refiere al uso de una oligonucleobase recombinagénica para para producir una mutación deseada en las secuencias cromosómicas o episómicas de una planta en el gen que codifica 5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). La proteína mutada, que mantiene sustancialmente la actividad catalítica de la proteína de tipo silvestre, permite la resistencia aumentada o tolerancia de la planta a un herbicida de la familia de fosfonometilglicina, y permite el crecimiento o desarrollo sustancialmente normal de la planta, sus órganos, tejidos o células en comparación con la planta de tipo silvestre independientemente de la presencia del herbicida. La presente invención también se refiere a una célula de £. coli que tiene un gen de EPSPS mutado, a una célula vegetal no transgénica en la que se ha mutado el gen de EPSPS, a una planta no transgénica regenerada a partir de esta, así como a una planta que es el resultado de un cruce entre una planta regenerada no transgénica que tiene un gen de EPSPS mutado al igual que uno de los progenitores del cruce. La presente proteína EPSPS mutada se ha cambiado en las posiciones de aminoácidos 178 y 182 en la proteína EPSPS de Arabidopsis (NM 130093) o en un resto de aminoácido análogo en un parálogo de EPSPS.

Antecedentes de la invención

Herbicidas de fosfonometilglicina

Las plantas tolerantes a herbicidas pueden reducir la necesidad de labranza para controlar las hierbas, de este modo reduciendo de manera eficaz la erosión del suelo. Un herbicida que es objeto de mucha investigación a este respecto es la N-fosfonometilglicina, citada comúnmente como glifosato. El glifosato inhibe la ruta del ácido shikímico que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos, incluyendo aminoácidos, hormonas y vitaminas. Específicamente, el glifosato frena la conversión del ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y del ácido 3-fosfoshikímico a ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikímico inhibiendo la enzima 5-enolpiruviisbikimato-3-fosfato sintasa (en lo sucesivo citada como EPSP sintasa o EPSPS). Para los fines de la presente invención, el término "glifosato" incluye cualquier forma eficaz de herbicida de N-fosfonometilglicina (incluyendo cualquier sal de la misma), otras formas que sean el resultado de la producción del anión glifosato en plantas y cualesquiera otros herbicidas de la familia de fosfonometilglicina.

La tolerancia de las plantas a glifosato puede aumentarse introduciendo un gen de EPSPS mutante que tiene una alteración en la secuencia codificante de aminoácidos de EPSPS en el genoma de la planta. Los ejemplos de algunas de las mutaciones en el gen de EPSPS para inducir tolerancia a glifosato se describen en las siguientes patentes: Patente de los Estados Unidos N° 5.310.667; Patente de los Estados Unidos N° 5.866.775; Patente de los Estados Unidos N° 5.312.910; Patente de los Estados Unidos N° 5.145.783. Estas mutaciones propuestas tienen típicamente un Ki mayor para el glifosato que la enzima de EPSPS de tipo silvestre, lo que confiere el fenotipo tolerante a glifosato, pero estas variantes también están caracterizadas por una Km para PEP que hacen a la enzima cinéticamente menos eficaz (Kishore y col., 1998, Ann. Rev. Biochem. 57:627 -663; Schulz y col., 1984, Arch. Microbiol. 137:121 -123; Sost y col., 1984, FEBS Lett. 173:238-241; Kishore y col., 1986, Fed. Proc. 45:1506; Sost y Amrhein, 1990, Arch. Biochem. Biophys. 282: 433-436). Se seleccionan muchas mutaciones del gen EPSPS para producir una enzima EPSPS que sea resistente a los herbicidas, pero desafortunadamente, la enzima EPSPS producida por el gen de EPSPS mutado tiene una actividad enzimática significativamente inferior a la EPSPS de tipo silvestre. Por ejemplo, la Km aparente para PEP y la K aparente para glifosato para la EPSPS de tipo silvestre de E. coli son 10 pM y 0,5 pM, respectivamente, mientras que para un aislado tolerante a glifosato que tiene una sola sustitución de aminoácidos de alanina por glicina en la posición 96, estos valores son 220 pM y 4,0 mM, respectivamente. Se han construido mediante mutagénesis un número de genes de EPSPS tolerantes a glifosato. Igualmente, la EPSPS tolerante a glifosato tenía una eficacia catalítica menor (Vmáx/Km), según se demostró por un aumento en la Km para PEP, y una ligera reducción de la Vmáx de la enzima de la planta de tipo silvestre (Kishore y col., 1998, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663).

Ya que las constantes cinéticas de las enzimas variantes están alteradas con respecto a PEP, se ha propuesto que elevados niveles de la sobreproducción de la enzima variante, 40-80 veces, puede ser necesaria para mantener una actividad catalítica normal en plantas en presencia de glifosato (Kishore y col., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663). Se ha demostrado que las plantas tolerantes a glifosato pueden producirse insertando en el genoma de la planta la capacidad para producir una cantidad mayor de EPSP sintasa en los cloroplastos de las células (Shah y col., 1986, Science 233, 478-481), dicha enzima es preferentemente tolerante a glifosato (Kishore y col., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663).

La introducción de los genes de EPSPS mutantes exógenos en la planta está bien documentada. Por ejemplo, según la Patente de los Estados Unidos N° 4.545.060, para aumentar la resistencia de la planta al glifosato, se introduce en el genoma de la planta un gen que codifica una variante de EPSPS que tiene al menos una mutación que hace a la enzima más resistente a su inhibidor competitivo, es decir, glifosato. Sin embargo, muchas complicaciones y problemas se asocian con estas plantas transgénicas que contiene genes de EPSPS mutantes. Muchas de estas mutaciones dan como resultado una baja expresión del gen de EPSPS mutado o dan como resultado un producto

génico de EPSPS con una actividad enzimática significativamente menor en comparación con la de tipo silvestre. La baja expresión o baja actividad enzimática de la enzima mutada da como resultado niveles anormalmente bajos de crecimiento y desarrollo de la planta.

Mientras que dichas variantes en las EPSP sintasas han demostrado ser útiles para obtener plantas transgénicas tolerantes al glifosato, puede ser aún más beneficioso obtener una variante de producto génico de EPSPS que sea elevadamente tolerante al glifosato pero aún cinéticamente eficaz, de tal forma que pueda obtenerse una tolerancia mejorada con un nivel de expresión de tipo silvestre.

Oliaonucleobases recombinaaénicas

Las oligonucleobases recombinagénicas y su uso para efectuar cambios genéticos en células eucariotas se describen en la Patente de los Estados Unidos N° 5.565.350 de Kmiec (Kmiec I). Kmiec I enseña un procedimiento para introducir alteraciones genéticas específicas en un gen diana. Kmiec I divulga, entre otras cosas, oligonucleobases recombinagénicas que tienen dos hebras, en las que una primera hebra contiene dos segmentos de al menos 8 nucleótidos de tipo ARN que están separados por un tercer segmento de 4 a aproximadamente 50 nucleótidos de tipo ADN, citados como un "segmento de ADN interpuesto". Los nucleótidos de la primera hebra están emparejados por bases a nucleótidos de tipo ADN de una segunda hebra. La primera y la segunda hebra están unidas adicionalmente por un segmento monocatenario de nucleótidos de tal forma que la primera y la segunda hebra son partes de una sola cadena de oligonucleótidos. Kmiec I además enseña un procedimiento para introducir alteraciones genéticas específicas en un gen diana. Según Kmiec I, las secuencias de los segmentos de ARN se seleccionan para que sean homologas, es decir, idénticas, con la secuencia de un primery un segundo fragmento del gen diana. La secuencia del segmento de ADN interpuesto es homologa con la secuencia del gen diana entre el primer y el segundo fragmento a excepción de una región de diferencia, citada como la "región heteróloga". La región heteróloga puede efectuar una inserción o eliminación, o puede contener una o más bases que están desemparejadas con la secuencia del gen diana para efectuar una sustitución. Según Kmiec I, la secuencia del gen diana se altera de la dirigida por la región heteróloga, de tal forma que el gen diana se hace homólogo con la secuencia de la oligonucleobase recomblnagénlca. Kmiec I enseña específicamente que los nucleótidos que contienen ribosa y 2'-0-metilribosa, es decir, 2'-metoxirr¡bosa, pueden usarse en oligonucleobases recombinagénicas y que los nucleótidos de origen natural que contienen desoxirribosa pueden usarse como nucleótidos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una planta no transgénica, resistente o tolerante a herbicida que comprende:

introducir en células vegetales una oligonucleobase recombinagénica con una mutación dirigida en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen de EPSPS mutante que expresa una proteína EPSPS que está mutada en las posiciones de aminoácidos Thri79 y Proi83 en una proteína EPSPS de Arabidopsis (AF360224) o en un resto de aminoácido análogo en una proteína EPSPS de otra especie en la que ThP|79 se cambia a lie y Pro-i83 se cambia a Thr; seleccionar una célula vegetal que muestra una tolerancia mejorada al glifosato en comparación con una célula vegetal de tipo silvestre correspondiente; y

regenerar una planta no transgénica resistente o tolerante a herbicida que tiene un gen de EPSPS mutado de dicha célula vegetal seleccionada.

2. Un procedimiento de producción de una planta no transgénica, resistente o tolerante a herbicida que comprende:

introducir en células vegetales una oligonucleobase recombinagénica con una mutación dirigida en el gen EPSPS para producir células vegetales con un gen de EPSPS mutante que expresa una proteína EPSPS que está mutada en las posiciones de aminoácidos ThP|79y Pro-i83 en una proteína EPSPS de Arabidopsis (AF360224) o en un resto de aminoácido análogo en una proteína EPSPS de otra especie en la que Thri79 se cambia a lie y Proi83 se cambia a Thr; identificar una célula vegetal que tiene proteína EPSPS mutante que muestra sustancialmente la misma actividad catalítica que una proteína EPSPS de tipo silvestre, y que muestra esta actividad incluso en presencia de glifosato; y regenerar una planta no transgénica resistente o tolerante a herbicida que tiene un gen de EPSPS mutado de dicha célula vegetal.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2 en el que la oligonucleobase recombinagénica es introducida mediante electroporación.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que las células vegetales son seleccionadas del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, cebada, soja, algodón, remolacha azucarera, colza, cañóla, lino, girasol, patata, tabaco, tomate, alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, guisantes, lentejas, uva, césped, y Brassica

sp.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que las posiciones de aminoácidos son Thn 02 y Proio6 en la proteína EPSPS de Zea mays;

Thn 74 y Proi78 en la proteína EPSPS de una Brassica sp\

Thn 74 and Pro-178 en la proteína EPSPS de Petunia hybrida; o Thr-178 y Pro-182 en la proteína EPSPS de Arabidopsis (NM 130093).

6. Un procedimiento para producir una célula de E. coli no transgénica que tiene un gen de EPSPS mutante que comprende:

Introducir en células de £. coli una oligonucleobase recombinagénica con una mutación dirigida en el gen EPSPS para producir células de E. coli con un gen de EPSPS mutante que expresa una proteína EPSPS que está mutada en las posiciones de aminoácidos Thr97 y Pro-ioi en la que Thr97 se cambia a lie y Proioi se cambia a Thr; identificar una colonia de células de E. coli que tiene un crecimiento sustancialmente normal en presencia de glifosato; y aislar una o más células de E. coli que contienen al gen de EPSPS mutante.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la oligonucleobase recombinagénica es un nucleótido de doble hélice mixto o un SSOMV.

8. El procedimiento según la reivindicación 7 en el que el nucleótido de doble hélice mixto contiene una primera región homologa que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de al menos 6 pares de bases del primer fragmento del gen de EPSPS diana y una segunda región homologa que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de al menos 6 pares de bases de un segundo fragmento del gen de EPSPS diana, y una región interviniente que contiene al menos una nucleobase heteróloga para el gen de EPSPS diana, contactando dicha región interviniente a la primera y a la segunda región homologa.

9. Una planta resistente a herbicida que expresa un producto génico de EPSPS mutante en la que el gen de EPSPS está mutado en posiciones para cambiar en las posiciones de aminoácidos Thn79 y Proi83 en una proteína EPSPS de Arabidopsis (AF360224) o en un resto análogo de aminoácido en un homólogo de EPSPS en el que Thn79 se cambia a lie y Proi83 se cambia a Thr.

10. La planta según la reivindicación 9 en la que la planta es seleccionada del grupo que consiste en maíz, trigo, arroz, cebada, soja, algodón, remolacha azucarera, colza, cañóla, lino, girasol, patata, tabaco, tomate, alfalfa, álamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, guisantes, lentejas, uva, césped, y Brassica sp.

11. La planta según las reivindicaciones 9 a 10 en el que las posiciones de aminoácidos son

Thrio2 y Proio6 en la proteína EPSPS de Zea mays\

Thr-174 y Proi78 en la proteína EPSPS de una Brassica sp;

Thrw and Proi78 en la proteína EPSPS de Petunia hybrida; o 5 Thr-Rs y Proi82 en la proteína EPSPS de Arabidopsis (NM 130093).

12. Una proteína EPSPS muíante que comprende la secuencia de aminoácidos del producto génico de EPSPS de £. coli ¡lustrado en la FIG. 1 o de un homólogo de EPSPS en el que las posiciones de aminoácidos Thr97 y Pro-ioi están cambiadas, en las que Thrg7 está cambiada a lie y Pro-ioi está cambiada a Thr, teniendo dicha proteína EPSPS muíante una resistencia o tolerancia aumentada a un herbicida de fosfonometilglicina.

13. Una célula de E. coli mutante que expresa un producto génico de EPSPS muíante en la que el gen de EPSPS está

mutado para cambiar las posiciones de aminoácidos Thr97 y Pro-ioi en el producto génico, en el que Thr97 se cambia a lie y Proioi se cambia a Thr.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha planta resistente o tolerante a herbicida es seleccionada del grupo que consiste en maíz, trigo, remolacha azucarera, patata, cañóla; y en el que

dicho herbicida es glifosato.

15. La planta según la reivindicación 9, en el que dicha planta resistente o tolerante a herbicida se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, remolacha azucarera, patata, cañóla; y en el que dicho herbicida es glifosato.