Ensayo de biomarcadores para fibrosis.

Un método para el diagnóstico o la cuantificación de la fibrosis que es diferente de un diagnóstico o cuantificación de la aterosclerosis,

que comprende, realizar un inmunoensayo en una muestra de biofluido que se obtiene de un paciente para medir los fragmentos de proteína que contienen un neo-epítopo naturalmente presente en dicha muestra, y que asocian una elevación de dicha medición en dicho paciente por encima de un nivel normal con la presencia o el grado de la fibrosis, en donde dicho inmunoensayo se lleva a cabo por un método que comprende:

poner en contacto los fragmentos de proteínas naturalmente presentes en dicha muestra con una pareja de unión inmunológica específicamente reactiva con un neo-epítopo N-terminal que se forma por el clivaje de una proteína por una proteinasa o con un neo-epítopo C-terminal que se forma por el clivaje de una proteína por una proteinasa, cuya pareja de unión inmunológica es no reactiva con la proteína intacta de la que deriva el epítopo, y medir el grado de unión de los fragmentos peptídicos a dicha pareja de unión inmunológica para medir en los mismos los fragmentos de proteína que comprenden dicho neo-epítopo, y en donde dicha proteína es el colágeno tipo III.

Ensayo de biomarcadores para fibrosis La presente invención se refiere a ensayos de biomarcadores útiles en el diagnóstico de la enfermedad de la fibrosis y en el pronóstico de su desarrollo, incluyendo biomarcadores que indican el riesgo de desarrollar fibrosis después de una lesión crónica.

Las enfermedades fibróticas (incluidas las que se enumeran en la Tabla 1) son la principal causa de morbilidad y mortalidad, 10 por ejemplo, la cirrosis con 800, 000 muertes por año en el mundo1.

Tabla 1. Diferentes enfermedades fibróticas2

Tejido Ejemplos de Causas

Hígado Hepatitis virales

Esquistosomiasis

Esteatohepatitis (alcohólica o no alcohólica)

Pulmón Fibrosis pulmonar idiopática (IPF)

Esclerosis sistémica (Esclerodermia)

Riñón Fibrosis sistémica nefrogénica (NSF)

Diabetes

Hipertensión no tratada

Corazón Infarto

Hipertensión

Ateroesclerosis

Restenosis

Ojos Degeneración macular, retinopatía vítrea y retinal

Piel Esclerosis sistémica y esclerodermia, queloides, cicatrices hipertróficas, quemaduras, factores genéticos NFS

Páncreas Causas autoinmunes/hereditarias

Intestino Enfermedad de Crohn/enfermedad intestinal inflamatoria

Cerebro Enfermedad de Alzheimer, SIDA

Médula ósea Cáncer, envejecimiento

Fibrosis multiorgánica Complicaciones quirúrgicas, fibrosis que se induce por fármacos quimioterapéuticos, fibrosis que se induce por radiación, lesiones mecánicas

Una "enfermedad fibrótica" es cualquier enfermedad que da lugar a la fibrosis, ya sea como síntoma principal o secundario.

La fibrosis es el resultado final de las reacciones inflamatorias crónicas que se inducen por una variedad de estímulos que incluyen las infecciones persistentes, las reacciones autoinmunes, las respuestas alérgicas, los daños químicos, la radiación y la lesión tisular. La fibrosis se caracteriza por la acumulación y la reorganización de la matriz extracelular (ECM) . A pesar 55 de tener distinciones etiológicas y clínicas evidentes, la mayoría de los trastornos fibróticos crónicos tienen en común una irritación persistente que sustenta la producción de factores de crecimiento, enzimas proteolíticas, factores angiogénicos y citocinas fibrogénicas, que en conjunto estimulan la deposición de elementos del tejido conectivo, especialmente de colágenos y proteoglicanos, que remodelan progresivamente y destruyen la arquitectura normal del tejido 3, 4. A pesar de su

enorme impacto en la salud humana, actualmente no existen tratamientos aprobados que se destinen directamente a los mecanismos de la fibrosis 5.

El mediador celular clave de la fibrosis es el miofibroblasto, que al activarse sirve como célula primaria productora de 5 colágeno.

Matriz Extracelular (ECM)

La fibrogénesis es un proceso dinámico que implica mecanismos celulares y moleculares complejos que generalmente se originan en la lesión tisular 6. La fibrogénesis es el resultado de un desequilibrio en la regulación normal de la ECM que altera la concentración de las macromoléculas lo que conduce a un aumento del tamaño y de la densidad del tejido, con deterioro progresivo de su función. Estas macromoléculas son principalmente proteínas fibrosas con funciones adhesivas y estructurales, tales como colágenos y proteoglicanos.

Colágeno Los colágenos se distribuyen de manera amplia en el cuerpo humano, es decir ~ 30 % de la masa de proteínas en el cuerpo humano se compone de colágenos. Los colágenos son responsables de la integridad estructural de la ECM de la mayoría de los tejidos conectivos. El contenido de la ECM resulta de un fino equilibrio entre la síntesis y la degradación que se controla estrechamente mediante la regulación de la expresión génica y la secreción de proteínas, pero también a través de la inhibición endógena de las proteasas y la degradación de las proteínas por las metaloproteinasas y las proteasas de cisteína 7-9. En la Tabla 2 se enumeran los principales tipos de colágeno con su principal distribución tisular.

Tabla 2. Principales tipos de colágeno y su distribución en los tejidos.

Tipo de colágeno Distribución tisular

I Mayoría de los tejidos conectivos

II Cartílago, humor vítreo

III Tejidos conectivos extensibles, por ejemplo, hígado, piel, pulmón, sistema vascular

IV Membranas basales

V Tejidos que contienen colágeno I

VI Mayoría de los tejidos conectivos

VII Piel, vejiga, mucosa oral, cordón umbilical, amnios

VIII Muchos tejidos, especialmente el endotelio

XIII Células endoteliales, piel, ojos, corazón, músculo esquelético

XIV Vasos, hueso, piel, cartílago, ojos, nervios, tendones, útero

XXI Vasos, corazón, estómago, riñones, músculo esquelético, placenta

El colágeno tipo I es el colágeno más abundante y se encuentra en la mayoría de los tejidos conectivos. Es especialmente importante para la estructura de los huesos y de la piel donde los principales componentes de colágeno son los colágenos 50 detipoIyIII 10 .

Los colágenos tipo I y III son los principales componentes del hígado y del pulmón en una relación 1:1 en los tejidos sanos. Adicionalmente, los colágenos tipo IV y VI se encuentran en las membranas basales en la mayoría de los tejidos. La localización más frecuente del colágeno de tipo V es dentro de las fibrillas de colágeno características, en asociación con los 55 colágenos de tipo I y III 10 .

Algunos colágenos tienen una distribución tisular restringida: por ejemplo, el de tipo II, que se encuentra casi exclusivamente en el cartílago 11 .

Durante la fibrogénesis la cantidad neta de colágeno aumenta12-14. La Tabla 3 muestra, en forma de ejemplo, el aumento de colágeno durante la fibrosis hepática.

Tabla 3. Cambios de la composición de colágeno entre el hígado humano normal y el cirrótico15 .

Tipo de colágeno Cadenas Colágeno del hígado normal (mg/g) Colágeno del hígado cirrótico (mg/g) Veces que aumentó Distribución en el hígado normal ( %) Distribución en el hígado cirrótico ( %)

I α1 (I) 16 8 37 42

α2 (I) 2

III α1 (III) 2 8 4 37 21

IV α1 (IV) 0.5 7 14 9 18

α2 (IV)

V α1 (V) 0.9 7 8 17 18

α2 (V)

α3 (V)

VI α1 (VI) 0.01 0.1 10 0.2 0.3

α2 (VI)

Elastina La elastina es una proteína presente en muchos tejidos conectivos, fundamentalmente en los que son elásticos. Tiene un muy alto contenido de los aminoácidos glicina, valina, alanina y prolina, y tiene un peso molecular de 64 a 66 kDa. Se organiza en una conformación helicoidal irregular o al azar compuesta por 830 aminoácidos. La elastina se elabora mediante el enlace de muchas moléculas solubles de la proteína tropoelastina, en una reacción que se cataliza por la lisil

oxidasa, para elaborar una matriz reticulada durable, insoluble masiva.

La elastina cumple una importante función en las arterias como un medio para la propagación de la onda de presión para ayudar al flujo sanguíneo y es particularmente abundante en los grandes vasos sanguíneos elásticos tales como la aorta. La elastina es también muy importante en los pulmones, los ligamentos elásticos y la piel.

A pesar de muchos esfuerzos que se dedican a la comprensión de la síntesis y de la facturación de la elastina, los neoepítopos procedentes del clivaje proteolítico de estas moléculas de la matriz no se asocian hasta ahora con el desarrollo de la enfermedad en la fibrosis.

Vimentina La vimentina es un miembro de la familia de proteínas de filamentos intermedios. Los filamentos intermedios son una importante característica estructural de las células eucariotas. Ellos, junto con los microtúbulos y microfilamentos de actina, constituyen el citoesqueleto. Aunque la mayoría de los filamentos intermedios son estructuras estables, en los fibroblastos,

la vimentina existe como una estructura dinámica. Este filamento se utiliza como un marcador de los tejidos que se derivan del mesodermo, y como tal se utiliza como un marcador inmunohistoquímico para los sarcomas.

Hertig y colaboradores (Hertig y otros, J Am Soc Nephrol. 2008 agosto; 19 (8) :1584-91) investigaron si la transición epiteliala-mesenquimal en las células epiteliales tubulares renales de pacientes con nefropatía crónica del aloinjerto podía predecir

la progresión de la fibrosis en el aloinjerto y midieron la expresión de vimentina en 83 biopsias de estos. Ellos encontraron una asociación entre la expresión elevada de la vimentina y la puntuación de la fibrosis intestinal a 1 año después de la cirugía.

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1. Un método para el diagnóstico o la cuantificación de la fibrosis que es diferente de un diagnóstico o cuantificación de la aterosclerosis, que comprende, realizar un inmunoensayo en una muestra de biofluido que se obtiene de un paciente para medir los fragmentos de proteína que contienen un neo-epítopo naturalmente presente en dicha muestra, y que asocian una elevación de dicha medición en dicho paciente por encima de un nivel normal con la presencia o el grado de la fibrosis, en donde dicho inmunoensayo se lleva a cabo por un método que comprende:

poner en contacto los fragmentos de proteínas naturalmente presentes en dicha muestra con una pareja de unión inmunológica específicamente reactiva con un neo-epítopo N-terminal que se forma por el clivaje de una proteína por una proteinasa o con un neo-epítopo C-terminal que se forma por el clivaje de una proteína por una proteinasa, cuya pareja de unión inmunológica es no reactiva con la proteína intacta de la que deriva el epítopo, y medir el grado de unión de los fragmentos peptídicos a dicha pareja de unión inmunológica para medir en los mismos los fragmentos de proteína que comprenden dicho neo-epítopo, y en donde dicha proteína es el colágeno tipo III.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicha pareja de unión inmunológica se une específicamente a los fragmentos de colágeno tipo III que tienen una secuencia N-terminal KNGETG…

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicha pareja de unión inmunológica se une

específicamente a un neo-epítopo constituido por una secuencia de aminoácidos N-terminal presente en los péptidos que se producen por el clivaje del colágeno tipo III, dichos péptidos comprenden una secuencia N-terminal que se selecciona del grupo que consiste en:

Colágeno tipo III

GIPGAP... SEQ ID NO372 GDPGPP... SEQ ID NO373 LAGPPG... SEQ ID NO89

IAGITG... SEQ ID NO375 IKGHRG... SEQ ID NO376 RGLAGP... SEQ ID NO377

KGDAGQ... SEQ ID NO381 ITGARG... SEQ ID NO379 VKGESG... SEQ ID NO380

GKSGDR... SEQ ID NO383 LQGLPG... SEQ ID NO384 LRGGAG... SEQ ID NO382

DGTSGH... SEQ ID NO135 IGSPGP... SEQ ID NO AIGSPG... SEQ ID NO143

GPPGVA... SEQ ID NO158 AGPPGM... SEQ ID NO145 LSGERG... SEQ ID NO176

GARGLA... SEQ ID NO111 GAPGEK... SEQ ID NO141 PQGPPG... SEQ ID NO389

KGESGK... SEQ ID NO374 GLSGER... SEQ ID NO387 YQGPPG... SEQ ID N0401

QPGVMG... SEQ ID NO144 IPGAPG... SEQ ID NO117 FRGPAG... SEQ ID NO137

GPPGPT... SEQ ID NO391 INGSPG... SEQ ID NO392 GPPGEP... SEQ ID NO393

GLPGPP... SEQ ID NO394 KNGETG... SEQ ID NO395 LPGIAG... SEQ ID NO396

GINGSP... SEQ ID NO397 PGENGK... SEQ ID NO398 LKGENG... SEQ ID NO399

LMGARG... SEQ ID NO400 GKDGES... SEQ ID NO418 QQGAIG... SEQ ID NO390

DKGEPG... SEQ ID NO403 GHAGAQ... SEQ ID NO404 GERGAP... SEQ ID NO402

PGMKGH... SEQ ID NO406 FPGARG... SEQ ID NO407 GFPGAR... SEQ ID NO408

FPGMKG... SEQ ID NO409 PGDKGE... SEQ ID NO410 GDKGET... SEQ ID NO411

GQPGDK... SEQ ID NO412 GPPGEN... SEQ ID NO413 AAGFPG... SEQ ID NO417

GERGSP... SEQ ID NO415 PGVPGA... SEQ ID NO416 GARGND... SEQ ID NO419

GSDGQP... SEQ ID NO405 GPPGPP... SEQ ID NO100 GGAGPP... SEQ ID NO425

GFPGAP... SEQ ID NO420 GAAGEP... SEQ ID NO421 GARGPP... SEQ ID NO422

PGPQGH... SEQ ID NO426 PGFPGM... SEQ ID NO427 GSPGGP.... SEQ ID NO428

PGPPGI... SEQ ID NO432 GITGAR... SEQ ID NO430 GIAGIT... SEQ ID NO431

GPPGSN... SEQ ID NO423 RPGLPG... SEQ ID NO436 GAPGPM... SEQ ID NO438

PQGLQG... SEQ ID NO440 GPPGVA... SEQ ID NO158 SGDRGE... SEQ ID NO429

GAPGFR... SEQ ID NO435 PGFRGP... SEQ ID NO443 GPVGPS... SEQ ID NO447

GAPGPQ... SEQ ID NO445 GFPGNP... SEQ ID NO446 GPPGIN... SEQ ID NO470

GPTGPL.. SEQ ID NO448 GDAGQP... SEQ ID NO449 NGEKGE... SEQ ID NO450

KGSPGA... SEQ ID NO444 GSPGER... SEQ ID NO439 AIGPSG... SEQ ID NO368

GSRGAP... SEQ ID NO462 TGARGL... SEQ ID NO378 ERGLPG... SEQ ID NO385

NTGAPG... SEQ ID NO437 VGGLAG... SEQ ID NO155 VAGPPG... SEQ ID NO452

HAGAQG... SEQ ID NO434 PGAPGG... SEQ ID NO455 GIPGFP... SEQ ID NO414

PGPQGP... SEQ ID NO453 AGQQGA... SEQ ID NO457 PGPPGP... SEQ ID NO458

AGQPGE... SEQ ID NO454 GLAGPP... SEQ ID NO388 GRNGEK... SEQ ID NO460

VKGERG... SEQ ID NO159 GGAGEP... SEQ ID NO463 SPGGKG... SEQ ID NO459

GPPGAP... SEQ ID NO461 SPGAQG... SEQ ID NO465 PGVSGP... SEQ ID NO466

GSPGAQ... SEQ ID NO464 IKGPAG... SEQ ID NO169 PGAPGQ... SEQ ID NO456

PGAPGL... SEQ ID NO467 GIPGQP... SEQ ID NO468 SRGAPG... SEQ ID NO451

ESCPTG... SEQ ID NO433 DAGAPG... SEQ ID NO469 GPKGDA... SEQ ID NO424

GPAGIP... SEQ ID NO441

4. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicha pareja de unión inmunológica se une específicamente a un neo-epítopo constiuido por una secuencia de aminoácidos C-terminal presente en los péptidos que se producen por el clivaje del colágeno tipo III, dichos péptidos comprenden una secuencia C-terminal que se selecciona del grupo que consiste en:

Colágeno tipo III

...GPPGPA SEQ ID NO94 ...NGDPGI SEQ ID NO471 ...SPGPQG SEQ ID NO472

...GMPGPR SEQ ID NO473 ...SPGPAG SEQ ID NO474 ...PGPQGV SEQ ID NO475

...ERGAAG SEQ ID NO476 ...PGPLGI SEQ ID NO477 ...AAGTPG SEQ ID NO478

...ERGPPG SEQ ID NO147 ...PGPPGT SEQ ID NO479 ...GNRGER SEQ ID NO480

...GLPGLA SEQ ID NO486 ...APGLRG SEQ ID NO481 ...HPGSPG SEQ ID NO482

...GLAGTA SEQ ID NO488 ...GSPGPA SEQ ID NO484 ...GPAGPP SEQ ID NO485

...LAGPPG SEQ ID NO89 ...PGLMGA SEQ ID NO489 ...QGPPGP SEQ ID NO487

...IPGFPG SEQ ID NO492 ...GPPGPQ SEQ ID NO490 ...GFPGMK SEQ ID NO493

...FPGPKG SEQ ID NO491 ...GPAGIP SEQ ID NO441 ...FPGAPG SEQ ID NO494

...GPPGIC SEQ ID NO2187 ...PPGPPG SEQ ID NO119 ...FPGARG SEQ ID NO407

...PGPQGL SEQ ID NO497 ...GAPGLM SEQ ID NO498 ...GAIGPS SEQ ID NO495

...SPGPKG SEQ ID NO499 ...LPGAAG SEQ ID NO2188 ...APGPLG SEQ ID NO2189

...LPGPPG SEQ ID NO72 ...GPPGIN SEQ ID NO470 ...IPGQPG SEQ ID NO501

...GHRGFD SEQ ID NO503 ...PGLPGI SEQ ID NO504 ...GAAGIK SEQ ID NO505

...GLPGIA SEQ ID NO507 ...PGPKGD SEQ ID NO506 ...GPPGVA SEQ ID NO158

...GLPGPP SEQ ID NO394 ...GANGLP SEQ ID NO510 ...GPPGPS SEQ ID NO511

...TGARGL SEQ ID NO378 ...GPPGIK SEQ ID NO512 ...TAGFPG SEQ ID NO513

...PQGLPG SEQ ID NO508 ...GAPGLR SEQ ID NO509 ...GPQGVK SEQ ID NO524

...GTPGLQ SEQ ID NO521 ...GEVGPA SEQ ID NO514 ...GSPGPQ SEQ ID NO533

...GMKGHR SEQ ID NO531 ...GKPGAN SEQ ID NO537 ...QPGPPG SEQ ID NO536

...EMGPAG SEQ ID NO534 ...PGAAGF SEQ ID NO539 ...PGANGL SEQ ID NO529

...GVKGER SEQ ID NO538 ...GDAGAP SEQ ID NO542 ...GPAGER SEQ ID NO543

...GPPGPR SEQ ID NO544 ...GPAGPR SEQ ID NO545 ...RGFDGR SEQ ID NO546

AGPRGA SEQ ID NO547 ...GGKGER SEQ ID NO548 ...APGLMG SEQ ID NO549

...GRNGDP SEQ ID NO171 ...GPAGAN SEQ ID NO550 ...PQGVKG SEQ ID NO541

...AGIPGF SEQ ID NO496 ...VKGESG SEQ ID NO380 ...TGERGA SEQ ID NO540

...PPGPQG SEQ ID NO103 ...TGPRGP SEQ ID NO177 ...GSPGYQ SEQ ID NO526

...IPGAPG SEQ ID NO117 ...EPGPRG SEQ ID NO516 ...GAAGAR SEQ ID NO528

...TSGHPG SEQ ID NO518 ...GAPGPA SEQ ID NO519 ...TGAPGS SEQ ID NO502

...PSGPPG SEQ ID NO483 ...GTSGHP SEQ ID NO522 ...GTGGPP SEQ ID NO530

...PPGPAG SEQ ID NO52 ...GAPGLK SEQ ID NO525 ...GITGAR SEQ ID NO430

...FPGMKG SEQ ID NO409 ...GEPGPR SEQ ID NO500 ...GIAGPR SEQ ID NO535

...EKGPAG SEQ ID NO515 ...PGPKGN SEQ ID NO527 ...GLSGER SEQ ID NO387

...MPGPRG SEQ ID NO523 ...PPGAPG SEQ ID NO517 ...EGGPPG SEQ ID NO532

...GIPGAP SEQ ID NO372 ...TPGLQG SEQ ID 520 ...GFPGAR SEQ ID NO408