Dispositivo electródico para la detección de sulfitos, procedimiento de fabricación y uso de dicho dispositivo.

Dispositivo electródico para la detección de sulfitos, con tres electrodos,

uno de referencia, otro de trabajo y otro auxiliar, obtenidos todos los electrodos por serigrafía, el área activa del electrodo de referencia incluye tinta de plata/cloruro de plata, la del contraelectrodo tinta de carbono y la del electrodo de trabajo con una tinta de carbono que incorpora tetratiafulvaleno (TTF) al 3%, sobre una lámina plástica de poliéster, modificándose el área activa del de trabajo con la enzima sulfito oxidasa (SOx) en su superficie mediante entrecruzamiento con glutaraldehído (GA) y seroalbúmina bovina (BSA), así como su procedimiento de fabricación y su uso en la detección citada, de manera simple, con bajo coste y en relativo corto tiempo de análisis.

Dispositivo electródico para la detección de sulfitos, procedimiento de fabricación y uso de dicho dispositivo OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se enmarca en el campo de la electroquímica aplicada al análisis 5 químico.

Así, la presente invención se refiere a un dispositivo constituido par un sistema electródico para la detección de sulfito, con tres electrodos, obtenidos todos los electrodos por serigrafía, modificándose uno de ellos posteriormente con una enzima, así como su procedimiento de 10 fabricación y condiciones de uso en la detección citada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las celdas electroquímicas son de gran interés en el análisis de sustancias debido a su 15 robustez, fabricación sencilla y económica.

Una de las técnicas más utilizadas para la fabricación de los electrodos que se utilizan en las celdas electroquímicas es la serigrafía. Esta técnica permite construir sensores químicos con una reproducibilidad y una infraestructura mínima. 20

La serigrafía es un método de impresión directa, también llamado de impresión por penetración. La deposición de tintas se realiza capa a capa sobre un sustrato. La calidad de los sensores químicos así fabricados depende, en gran medida, de los materiales utilizados.

Mediante la tecnología de electrodos serigrafiados es posible la miniaturización de los sensores ofreciendo la ventaja de ser versátiles, pueden ser fabricados con distintas configuraciones de electrodos y con diferentes tintas, y tener bajo coste pudiendo así prestarse para la producción en masa de electrodos desechables. Además pueden ser utilizados para análisis in situ.

Para aumentar la selectividad de los electrodos se modifican por diferentes métodos, por ejemplo inmovilizando una sustancia, frecuentemente un enzima, en su superficie que responda selectivamente a determinados analitos. La selectividad y la acción catalítica de las reacciones enzimáticas potencian la selectividad y sensibilidad de los dispositivos.

El método de inmovilización es muy importante ya qua condiciona la sensibilidad y estabilidad del sensor.

El método más común' y generalizado para el análisis de sulfito fue desarrollado por Monier-Williams, quien utilizó una técnica de valoración clásica, procedimiento que requiere bastante 40 tiempo. También se han utilizado otros métodos como espectrofotometría, electroforesis capilar y cromatografía. Sin embargo, estos procedimientos tienen algunas desventajas, tales como alto coste, tiempos de análisis largos y en algunos casos es necesario un pretratamiento de la muestra, qua los hace inadecuados para el análisis de rutina. Las técnicas electroquímicas han sido también tradicionalmente empleadas para la detección de sulfito. Principalmente se han 45 utilizado electrodos de pasta de carbón vítreo. Los problemas típicos asociados con estos procedimientos han sido el envenenamiento de los electrodos, que conducen a una pérdida en la sensibilidad. Además los altos potenciales a pie se opera inciden en la selectividad debido a la gran sobretensión aplicada para controlar la oxidación de sulfito. Con el fin de mejorar ambos factores, estos electrodos han sido modificados por complejos metálicos o agentes biológicos. En general, los biosensores se han desarrollado utilizando enzimas sulfito oxidasa (SOx) inmovilizados sobre diferentes electrodos, tales coma oro, platino o carbono. Para la modificación de los electrodos se han utilizado tanto nanomateriales (nanopartículas de oro, quitosan, nanopartículas magnéticas recubiertas de oro, ITO, nanotubos de carbono multicapa) 5 como polímeros (polianilina, polipirrol) , sin que estos dispositivos hayan solucionado por completo los problemas aludidos.

El mecanismo de medición de sulfito utilizando un biosensor enzimático se basa en el seguimiento de la reacción, catalizada par SOx en la que los sitios activos del molibdeno en 10 SOx, pasan por estados de oxidación y de reducción durante la oxidación catalítica de sulfito a sulfato. La detección indirecta de sulfito se puede lograr por distintos métodos como detectar el agotamiento de oxigeno o la generación de peróxido, siendo este último el método más sencillo aunque presenta nuevamente el inconveniente del gran sobrepotencial que se requiere generalmente. 15

La utilización de mediadores, añadidos a la celda electroquímica junto con el electrolito soporte, permite disminuir el potencial de uso, contribuyendo a evitar interferencias, y han sido frecuentemente utilizados. El potencial redox del tetratiafulvaleno (TTF) en torno a 100 mV, permite su utilización como mediador en el campo de los biosensores electroquímicos con 20 resultados óptimos. Sin embargo, la insolubilidad de esta sustancia ha limitado su uso a las disoluciones no acuosas. Este problema se puede solventar incorporando el TTF a la tinta de serigrafiado, originando así una pasta conductora con mediador incorporada para el serigrafiado directo del electrodo de trabajo.

En el biosensor propuesto, el enzima sulfito oxidasa en adelante (SOx) , interacciona específicamente con el sulfito catalizando su oxidación a sulfato. La inmovilización de este enzima sobre un electrodo serigrafiado permite poner a punto un dispositivo que aúna las ventajas de los dispositivos electródicos serigrafiados desechables con el uso de enzimas específicos para la detección de sulfito. 30

La presente invención solventa las desventajas de los dispositivos electródicos conocidos, y presenta gran simplicidad, bajo coste y corto tiempo de análisis, comparado con otras técnicas, por lo que supone un gran avance en su empleo para la determinación de sulfitos en distintos tipos de muestras, como por ejemplo muestras de vino. 35

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención queda establecida y caracterizada en las reivindicaciones independientes, mientras que las reivindicaciones dependientes describen otras características 40 de la misma.

El objeto de la invención es un dispositivo electródico, su procedimiento de fabricación y uso del mismo para la detección de sulfitos. El problema a resolver es constituir el dispositivo, llevar a cabo su fabricación y usarlo, todo ello de manera simple, con bajo coste y en relativo corto 45 tiempo de análisis, comparado con las técnicas conocidas.

A la vista de lo anteriormente enunciado, la presente invención se refiere a un dispositivo electródico para la detección de sulfitos en distintos tipos de muestras alimentarias, obtenido por serigrafía, caracterizado por que comprende tres electrodos, cada electrodo consta de un 50 contacto, un tramo y un área activa, siendo un electrodo de trabajo, uno auxiliar o contraelectrodo, y otro de referencia, constituidos todos los electrodos por serigrafía de una tinta de materiales conductores sobre una lámina plástica de poliéster. Las vías conductoras se han impreso con una tinta conductora de Ag, el de referencia con una tinta de Ag/AgC1 en el área activa, el área activa del contraelectrodo con una tinta de carbono y el área activa del electrodo de trabajo también con una tinta de carbono a la que se ha incorporado previamente tetratiafulvaleno (TTF) al 3%, y que se modifica posteriormente de manera que se inmoviliza el enzima sulfito oxidasa (SOx) en su superficie utilizando un agente bifuncional como el 5 glutaraldehído (GA) , mediante entrecruzamiento, en presencia de seroalbúmina bovina (BSA) .

Opcionalmente el dispositivo incluye un aislante que cubre el dispositivo, dejando libre los contactos y aéreas activas de los electrodos.

Asimismo, la presente invención se refiere a un proceso de fabricación del dispositivo anteriormente mencionado que comprende las siguientes etapas:

- serigrafiado de una lámina de poliéster con tinta de plata con las formas de los contactos y los tramos de los tres electrodos 15

- serigrafiado del área activa del electrodo de referencia con Ag/AgC1,

- serigrafiado del área activa del contrelectrodo con una pasta de carbono, 20

- serigrafiado de un aislante cubriendo el dispositivo, excepto las áreas activas de los electrodos y los bornes,

- serigrafiado del área activa de uno de los electrodos con pasta de carbono a la que se ha incorporado TTF, 25

- modificación del área activa de uno de los electrodos mediante inmovilización del enzima sulfito oxidasa (S0x) en su superficie mediante entrecruzamiento con glutaraldehído (GA) y seroalbúmina bovina (BSA) .

Y, la presente invención se refiere al uso del dispositivo anteriormente mencionado con la opción del aislante pie comprende las siguientes etapas:

- introducción del dispositivo en una celda...

1. Dispositivo electródico para la detección de sulfitos obtenido por serigrafía caracterizado por que comprende tres electrodos (1, 2, 3) , cada electrodo consta de un contacto o borne (1.3, 2.3, 3.3) , un tramo (1.2, 2.2, 3.2) y un área activa (1.1, 2.1, 3.1) , siendo uno de referencia (1) , otro de trabajo (2) , y otro auxiliar o contraelectrodo (3) , constituidos los bornes (1.3, 2.3, 3.3) y 5 los tramos (1.2, 2.2, 3.2) con una tinta de plata, el área activa del electrodo de referencia (1.1) con una tinta de plata/cloruro de plata, el área activa del contraelectrodo (3.1) con una tinta de carbono y el área activa del electrodo de trabajo (2.1) con una tinta de carbono que incorpora tetratiafulvalento (TTF) al 3%, sobre una lámina plástica de poliéster, estando el electrodo de trabajo (2) modificado de manera que se inmoviliza el enzima sulfito oxidasa (SOx) en su 10 superficie mediante entrecruzamiento con glutaraldehído (GA) y seroalbúmina bovina (BSA) .

2. Dispositivo electródico según la reivindicación 1 que incluye un aislante (4) que cubre el dispositivo, dejando libre los contactos (1.3, 2.3, 3.3) y aéreas activas (1.1, 2.1, 3.1) de los electrodos (1, 2, 3) . 15

3. Dispositivo electródico según la reivindicación 1 en el que los contactos (1.3, 2.3, 3.3) , los tramos (1.2, 2.2, 3.2) y el área activa (1.1) del electrodo de referencia (1) tienen forma rectangular.

4. Dispositivo electródico según la reivindicación 3 en el que el área activa (1.1) del electrodo de referencia tiene forma rectangular de 2 mm de anchura par 4 mm de longitud.

5. Dispositivo electródico según la reivindicación 3 en el que el área activa (2.1) del electrodo de 5 trabajo (2) es un círculo de 4.5 mm de diámetro. 25

6. Dispositivo electródico según la reivindicación 3 en el que el área activa (3.1) del contraelectrodo (3) tiene una anchura entre 1, 4 y 1, 5 mm, un tramo recto de entre 3 y 5 mm, que conecta con un arco de radio entre 3 y 5 mm.

7. Proceso de fabricación del dispositivo según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

- serigrafiado de una lámina de poliéster con tinta de plata con las formas de los contactos (1.3, 2.3, 3.3) y los tramos (1.2, 2.2, 3.2) de los tres electrodos (1, 2, 3) , 20 35

- serigrafiado del área activa (1.1) del electrodo de referencia (1) con Ag/AgC1,

- serigrafiado del área activa (3.1) del contrelectrodo (3) can una pasta de carbono,

- serigrafiado de un aislante (4) cubriendo el dispositivo excepto el área activa (1.2, 2.2, 3.2) de los electrodos (1, 2, 3) y los bornes (1.1, 2.1, 3.1) de los electrodos (1, 2, 3) ,

- serigrafiado del área activa (2.1) del electrodo de trabajo (2) con una pasta de carbono a la que se ha incorporado TTF al 3%, 45

- modificación del área activa (2.1) del electrodo de trabajo (2) mediante inmovilización del enzima sulfito oxidasa (SOx) en su superficie mediante entrecruzamiento con glutaraldehído (GA) y seroalbúmina bovina (BSA) .

8. Proceso de fabricación según la reivindicación 7 en el que la inmovilización del enzima SOx sobre el electrodo de trabajo (2) se realiza adicionando sobre el electrodo 1 μL de una disolución de BSA en 3% peso/volumen, 3 μL de una solución de glutaraldehído (GA) al 5% y 1 μL de una disolución SOx, dejando el electrodo inmovilizando durante 60 minutos a 4º C, posteriormente se lava con tampón fosfato.

9. Uso del dispositivo según las reivindicaciones y 2 caracterizado por que comprende las 5 siguientes etapas:

- introducción del dispositivo en una celda electroquímica que contiene 5 mL de una solución tampón de dihidrogenofosfato sódico con pH 6.0, 50 mM y KC1 100 mM, termostatizada a 40º C, 10

- unión de los contactos (1.3, 2.3, 3.3) de los electrodos a un potenciostato,

- aplicación de un potencial de 0.200 V entre el electrodo de trabajo (2) y el contraelectrodo (3) , 15

- espera a estabilización de corriente,

- adición de un volumen 100 μL de disolución problema que contiene sulfito,

- sucesivas adiciones 100 μL de disolución de patrón de sulfito, 20

- registro de las intensidades de corriente,

- representación de la recta de calibrado, 25

- extrapolación de dicha recta de calibrado para calcular la concentración de sulfito en la muestra problema.