Proteínas de fusión de albúmina.

Una proteína de fusión de albúmina que comprende (i) factor IX,

o un fragmento o una variante del factor IX, en la que la variante tiene al menos el 75 % de identidad de secuencia con el factor IX, fusionado con el extremo Nterminal de la (ii) albúmina humana, o un fragmento o una variante de la albúmina humana, en la que la variante tiene al menos el 75 % de identidad de secuencia con la SEC ID Nº: 18, en la que el factor IX o un fragmento o una variante del mismo tiene actividad biológica de factor IX, de tal forma que el factor IX o fragmento o variante del mismo, cuando esta en la forma activada, convierte el factor X en factor Xa mediante su interacción con iones calcio, fosfolípidos de membrana y factor VIII, y la variante o el fragmento de albúmina es capaz de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o el periodo de validez del factor IX en comparación con el factor IX sin fusionar, en la que el factor IX o un fragmento o una variante del mismo es la porción N-terminal de la proteína de fusión.

Proteínas de fusión de albúmina Antecedentes de la invención La invención se refiere a proteínas terapéuticas (incluidos, pero sin limitación, un polipéptido, o péptido, o fragmentos y variantes de los mismos) fusionadas con albúmina o fragmentos o variantes de la albúmina, que presentan un periodo de validez prolongado y/o una actividad terapéutica prolongada en disolución. En el presente documento, estas proteínas de fusión se denominan conjuntamente "proteínas de fusión de albúmina de la invención". La invención engloba proteínas de fusión de albúmina terapéuticas, composiciones, composiciones farmacéuticas y formulaciones. En la invención también se engloban moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, células huésped transformadas con ácidos nucleicos y procedimientos de fabricación de las proteínas de fusión de albúmina de la invención usando estos ácidos nucleicos y/o células huésped.

En el presente documento también se divulgan procedimientos de estabilización in vitro de una proteína terapéutica por fusión o conjugación de la proteína terapéutica con albúmina o fragmentos o variantes de la albúmina.

La seroalbúmina humana (SAH o AH) , una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura (como se muestra en la figura 2 o en la SEC ID Nº : 18) , es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica del suero y también funciona como transportador de ligandos endógenos y exógenos. En la actualidad, la AH para uso clínico se produce por extracción de la sangre humana. Se ha divulgado la producción de AH recombinante (AHr) en microorganismos en los documentos EP 330 451 y EP 361 991.

El papel de la albúmina como molécula transportadora y su naturaleza inerte son propiedades deseables para su uso como vehículo y transportador de polipéptidos in vivo. Se ha sugerido el uso de albúmina como componente de una proteína de fusión de albúmina como transportador para diversas proteínas en los documentos WO 93/15199, WO 93/15200 y EP 413 622. Con el uso de fragmentos N-terminales de HA se puede conseguir la proteína terapéutica por manipulación genética, de tal forma que el ADN que codifica la AH, o un fragmento del mismo, se une al ADN que codifica la proteína terapéutica. Después, se transforma o transfecta un huésped adecuado con las secuencias de nucleótidos fusionadas, dispuestas en un plásmido adecuado de modo que expresen un polipéptido de fusión. La expresión se puede efectuar in vitro, por ejemplo, a partir de células procariotas o eucariotas, o in vivo,

p. ej., a partir de un organismo transgénico.

Típicamente, las proteínas terapéuticas en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante, tales como los interferones y las hormonas de crecimiento, son moléculas lábiles que presentan periodos de validez cortos, en particular cuando se formulan en soluciones acuosas. La inestabilidad en estas moléculas cuando se formulan para su administración impone que muchas de las moléculas se deben liofilizar y refrigerar en todo momento durante el almacenamiento, lo que hace que las moléculas sean difíciles de transportar y/o almacenar. Los problemas de almacenamiento son particularmente graves cuando es necesario almacenar y dispensar las formulaciones farmacéuticas fuera del ámbito hospitalario. Muchos fármacos proteínicos y peptídicos también necesitan la adición de concentraciones elevadas de otra proteína, tal como la albúmina, para reducir o evitar la pérdida de proteína debida a la unión al recipiente. Esta es una de las principales preocupaciones con respecto a proteínas tales como el IFN. Por este motivo, muchas proteínas terapéuticas se formulan en combinación con una gran proporción de albúmina como molécula transportadora (exceso de 100-1000 veces) , aunque esta es una característica indeseable y cara de la formulación.

Se han propuesto pocas soluciones prácticas para los problemas de almacenamiento de las moléculas de proteína lábiles. En consecuencia, existe la necesidad de proporcionar formulaciones estabilizadas, de larga duración, de moléculas terapéuticas proteináceas que se dispensen con facilidad, preferentemente con una formulación sencilla que requiera una manipulación posterior al almacenamiento mínima.

Sumario de la invención La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que las proteínas terapéuticas se pueden estabilizar para prolongar su periodo de validez y/o para mantener la actividad de la proteína terapéutica durante periodos de tiempo prolongados en disolución, in vitro y/o in vivo, al fusionar o conjugar genética o químicamente la proteína terapéutica con albúmina o un fragmento (porción) o variante de la albúmina, que sea suficiente para estabilizar la proteína y/o su actividad. Además, se ha determinado que el uso de proteínas de fusión de albúmina o proteínas conjugadas con albúmina puede reducir la necesidad de formular soluciones de proteínas con grandes excesos de proteínas transportadoras (tales como albúmina, sin fusionar) para evitar la pérdida de proteínas terapéuticas debida a factores tales como la unión al recipiente.

El término "una proteína terapéutica" usado en la presente memoria descriptiva se refiere al factor IX. Adicionalmente, el término "albúmina" se refiere a la "albúmina humana". La presente invención engloba proteínas de fusión de albúmina que comprenden una proteína terapéutica (p. ej., un polipéptido o péptido, o fragmentos y variantes de los mismos) fusionada con albúmina o un fragmento (porción) o variante de la albúmina, que es

suficiente para prolongar el periodo de validez de la proteína terapéutica y/o estabilizar la proteína terapéutica y/o su actividad en disolución (o en una composición farmacéutica) in vitro y/o in vivo. En la invención también se engloban moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención, células huésped transformadas con estos ácidos nucleicos y procedimientos de preparación de las proteínas de fusión de albúmina de la invención y de uso de estos ácidos nucleicos y/o células huésped.

La invención también engloba formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de albúmina de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas formulaciones pueden estar en un kit o un recipiente. Este kit o recipiente puede estar empaquetado con instrucciones relativas al periodo de validez prolongado de la proteína terapéutica. Estas formulaciones se pueden usar en procedimientos de tratamiento, prevención, mejora o diagnóstico de una enfermedad o un síntoma de una enfermedad en un paciente, preferentemente un mamífero, lo más preferentemente un ser humano, que comprende la etapa de administrar la formulación farmacéutica al paciente.

En otros modos de realización, la presente invención engloba proteínas de fusión de albúmina para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad o trastorno. En modos de realización preferentes, la presente invención engloba proteínas de fusión de albúmina para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno enumerado en la columna de "Indicación preferente Y" de la tabla 1, que comprende administrar a un paciente en el que se desean dichos tratamiento, prevención o mejora, una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprende una porción de proteína terapéutica que corresponde a una proteína terapéutica (o un fragmento o una variante de la misma) divulgada en la columna "Proteína terapéutica X" de la tabla 1 (en la misma fila que se divulga la enfermedad o trastorno que se quiere tratar en la columna de "Indicación preferente Y" de la tabla 1) en una cantidad eficaz para tratar, evitar o mejorar la enfermedad o trastorno.

También se divulga en el presente documento un procedimiento para prolongar el periodo de validez de una proteína terapéutica (p. ej., un polipéptido o péptido, o fragmentos y variantes de los mismos) que comprende la etapa de fusionar o conjugar la proteína terapéutica con albúmina o un fragmento (porción) o variante de la albúmina, que es suficiente para prolongar el periodo de validez de la proteína terapéutica. La proteína terapéutica usada de acuerdo con este procedimiento se fusiona con la albúmina, o el fragmento o la variante de la albúmina. La proteína terapéutica usada de acuerdo con este procedimiento se fusiona con la albúmina, o un fragmento o una variante de la albúmina, por medio de tecnología de ADN recombinante o ingeniería genética.

También se divulga en el presente documento un procedimiento para estabilizar... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión de albúmina que comprende (i) factor IX, o un fragmento o una variante del factor IX, en la que la variante tiene al menos el 75 % de identidad de secuencia con el factor IX, fusionado con el extremo Nterminal de la (ii) albúmina humana, o un fragmento o una variante de la albúmina humana, en la que la variante tiene al menos el 75 % de identidad de secuencia con la SEC ID Nº : 18, en la que el factor IX o un fragmento o una variante del mismo tiene actividad biológica de factor IX,

de tal forma que el factor IX o fragmento o variante del mismo, cuando esta en la forma activada, convierte el factor X en factor Xa mediante su interacción con iones calcio, fosfolípidos de membrana y factor VIII, y la variante o el fragmento de albúmina es capaz de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o el periodo de validez del factor IX en comparación con el factor IX sin fusionar,

en la que el factor IX o un fragmento o una variante del mismo es la porción N-terminal de la proteína de fusión.

2. Una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el factor IX es factor IX maduro.

3. Una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el factor IX es un mutante por deleción N-terminal, un mutante por deleción C-terminal o un mutante por deleción N-terminal y C-terminal del factor

IX.

4. Una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la albúmina, o un fragmento o una variante de la albúmina, comprende los residuos de aminoácido de 1 a 585 de la SEC ID Nº : 18, o los residuos de aminoácido de 1 a 387 de la SEC ID Nº : 18, o los residuos de aminoácido de 1 a 194 de la SEC ID Nº : 18, o los residuos de aminoácido de 195 a 387 de la SEC ID Nº : 18, o los residuos de aminoácido de 388 a 585 de la SEC ID Nº : 18, o los residuos de aminoácido de 195 a 585 de la SEC ID Nº : 18, o los residuos de aminoácido de 1 a 194 combinados con los residuos de aminoácido de 388 a 585 de la SEC ID Nº : 18.

5. Una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el factor IX es fusionado con la albúmina, o un fragmento o una variante de la albúmina, por medio de un péptido enlazador, preferentemente un enlazador flexible.

6. Una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que no está glucosilada.

7. Una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la proteína de fusión tiene una actividad prolongada in vivo en comparación con el factor IX cuando no está fusionado con la albúmina, o un fragmento o una variante de la albúmina.

8. Una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la proteína de fusión tiene un periodo de validez prolongado en comparación con el factor IX cuando no está fusionado con la albúmina, o un fragmento o una variante de la albúmina.

9. Un medio de cultivo que comprende una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 que es una célula de mamífero, tal como una célula COS, CHO (de ovario de hámster chino) o NSO.

13. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 que es una célula de levadura que, opcionalmente, es deficiente en glucosilación y/o deficiente en proteasas y, preferentemente, es Saccharomyces cerevisiae.

14. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el polinucleótido tiene los codones optimizados para su expresión en levaduras.

15. Una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en la que la proteína de fusión es secretada de la célula huésped.

16. Un procedimiento para obtener una proteína de fusión de albúmina que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 y purificar la proteína de fusión.

17. Una proteína de fusión de albúmina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en terapia.

18. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Figura 1

Figura 2A

Figura 2B

Figura 2C

Figura 2D