Partículas de replicones de alfavirus emparejadas con antígenos proteicos como adyuvantes inmunológicos.

Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana que expresan una proteína inmunógena,

para usar en la potenciación de la respuesta inmunitaria contra la proteína inmunógena en un sujeto, en donde las partículas se administran a dicho sujeto simultáneamente con la proteína inmunógena, o en donde las partículas y la proteína inmunógena se administran simultáneamente a dicho sujeto y en el mismo sitio.

Partículas de replicones de alfavirus emparejadas con antígenos proteicos como adyuvantes inmunológicos Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a tecnología de ADN recombinante, y en particular a la introducción de ácido (s) nucleico (s) extraños en una célula eucariota, y más en particular a métodos para producir composiciones inmunógenas que comprenden partículas de virus infecciosas o partículas de tipo virus, con altos rendimientos, en especial partículas útiles en inmunoterapias, vacunas y/o composiciones inmunógenas. En particular, la presente solicitud describe preparaciones de partículas de replicones de alfavirus (ARP) altamente purificadas, en especial aquellas que expresan un antígeno de interés adecuado para usar en medicina humana y veterinaria y para potenciar la respuesta del sistema inmunitario frente a un antígeno administrado simultáneamente.

El género alfavirus incluye una variedad de virus, todos los cuales son miembros de la familia Togaviridae. Los alfavirus incluyen el virus de la encefalitis equina oriental (EEE) , virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) , virus Everglades, virus Mucambo, virus Pixuna, virus de la encefalitis equina occidental (WEE) , virus Sindbis, virus del bosque SemLiki, virus Middleburg, virus de Chikungunya, virus O’nyong-nyong, virus de Ross River, virus del bosque Barmah, virus Getah, virus Sagiyama, virus Bebaru, virus Mayaro, virus Una, virus Aura, virus Whataroa, virus Babanki, virus Kyzylagach, virus Highlands J, virus Fort Morgan, virus Ndumu y virus Buggy Creek. El genoma vírico es un ARN mensajero efector monocatenario, modificado en el extremo 5’ con un casquete metilado y en el extremo 3’ con un tramo de poli (A) de longitud variable. Las subunidades estructurales que contienen una sola proteína vírica, cápside, se asocian con el genoma de ARN en una nucleocápside icosaédrica. En el virión, la cápside está rodeada por una envuelta lipídica cubierta por una matriz regular de espículas de proteínas transmembrana, cada una de las cuales consiste en un complejo heterodímero de dos glucoproteínas, E1 y E2. Véase Pedersen et al., 1974, J. Virol. 14:40. Se considera que los virus Sindbis y del bosque de SemLiki son los alfavirus prototípicos, y se han estudiado ampliamente. Véase, Schlessinger, The Togaviridae and Flaviviridae, Plenum Publishing Corp., Nueva York (1986) . Los virus VEE se han estudiado ampliamente, véase, p. ej., la patente de EE.UU. nº 5.185.440.

Los estudios de estos virus han llevado al desarrollo de técnicas para vacunar contra las enfermedades producidas por alfavirus y contra otras enfermedades mediante el uso de vectores de alfavirus para la introducción de genes extraños. Véase la patente de EE.UU. nº 5.185.440, de Davis et al., y la publicación PCT WO 92/10578. El uso de vectores de alfavirus para dirigir la expresión de genes extraños en eucariotas se ha convertido en un tema de interés creciente. Se sabe bien que las vacunas de virus vivos atenuados están entre los medios más eficaces para controlar las enfermedades víricas u otras enfermedades. Sin embargo, para algunos patógenos víricos la inmunización con una cepa vírica viva puede ser poco práctica o no ser segura. Una estrategia alternativa es la inserción de secuencias que codifican antígenos inmunizadores de dichos agentes en una cepa de replicación viva de otro virus. Uno de dichos sistemas que usa un vector de VEE vivo se describe en las patentes de EE.UU. nº

5.505.947 y 5.643.576 de Johnston et al. Otro de dichos sistemas se describe en Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2679-2683 (1992) , en donde construcciones del virus Sindbis expresan una forma truncada de la proteína hemaglutinina del virus influenza. Otro sistema es el sistema de replicones alfavirus, descrito en la patente de EE.UU. nº 6.190.666 de Garoff et al., patentes de EE.UU. nº 5.792.462 y 6.156.558 de Johnston et al., patentes de EE.UU. nº 5.814.482, 5.843.723, 5.789.245, 6.015.694, 6.105.686 y 6.376.236 de Dubensky et al; solicitud publicada de EE.UU. nº 2002-0015945 A1 (Polo et al.) , solicitud publicada de EE.UU. nº 2001-0016199 (Johnston et al.) , Frolov et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11371-11377 y Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401.

El documento WO 2004/000872 no muestra la administración simultánea de una proteína de interés y partículas de replicones de alfavirus que expresan esa misma proteína de interés, pero esta publicación enseña una mutación en la partícula de alfavirus que se dice que potencia la inmunogenicidad de las propias partículas comparada con la de otras partículas de replicones de virus de VEE atenuados.

Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401 describe la administración de una preparación de partículas de replicones de virus de VEE que expresan un antígeno heterólogo para el VEE, pero no la administración simultánea de este antígeno proteico y las partículas de replicones de virus que expresan este antígeno.

Davis et al. (2000) Virology 74:371-378 enseña la administración de partículas de replicones de virus que expresan antígenos del virus de inmunodeficiencia simio, pero no la administración simultánea de este antígeno proteico y las partículas de replicones de virus que expresan este antígeno.

Goldberg et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11A:8114-8121 compara las respuestas inmunitarias logradas por la administración de una vacuna de ADN plasmídico para la tirosinasa o de partículas de replicones de virus vaccinia que expresan la tirosinasa, pero no la administración simultánea de la proteína y cualesquiera partículas de replicones de virus que expresan esta proteína.

Siguen siendo necesarios en la técnica métodos que permitan la producción de una respuesta inmunitaria más eficaz a una composición inmunógena administrada, en especial una composición inmunógena que comprende al menos un antígeno proteico y uno o más tipos de partículas de replicones de alfavirus que expresan el o los mismos

antígenos proteicos, en especial una composición que comprende menos antígeno que en una composición de vacuna convencional de dicho antígeno, en especial donde se busca una respuesta inmunitaria protectora o terapéutica, de modo que haya una enfermedad menos grave, riesgo menor de enfermedad o no haya enfermedad en respuesta al patógeno relevante, cáncer o trastorno metabólico.

Breve resumen Se proporcionan partículas de replicones de alfavirus para usar en la potenciación de la respuesta inmunitaria en un sujeto en el que se coadministra una proteína inmunógena y las partículas de replicones de alfavirus que expresan la proteína inmunógena. Las partículas se administran simultáneamente con la proteína inmunógena, o las partículas y la proteína inmunógena se administran simultáneamente y en el mismo sitio. En estos usos, la vía de administración puede ser subcutánea, intramuscular, intranasal, intravenosa, intraperitoneal o mucosa (genital, nasal, respiratoria, rectal o gastrointestinal) . La dosis de partículas de replicones de alfavirus puede ser al menos 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105 o 1 x 106 unidades infecciosas (UI) por ml, medido por ensayo en células cultivadas en condiciones permisivas a alfavirus, y refleja el nivel economizador de dosis que se puede conseguir mediante la práctica de los usos y composiciones de esta invención. Alternativamente, se pueden usar dosis más altas para conseguir una potenciación de una respuesta inmunitaria, en especial en enfermedades donde es más difícil elevar la respuesta inmunitaria robusta, p. ej., en el cáncer donde debe romperse la tolerancia al autoantígeno para lograr la respuesta inmunitaria. En dichas situaciones, la dosis de partículas de replicones de alfavirus usada puede ser la misma que la usada en ausencia de la proteína inmunógena. Típicamente, una dosis de partículas de replicones de alfavirus solas que es eficaz es al menos 1 x 106, y puede estar en el intervalo de 1 x 107, 1 x 108, y 1 x 109, UI por ml.

En los usos descritos en la presente memoria, las partículas de replicones de alfavirus se obtienen del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) , y preferiblemente se obtienen de una cepa atenuada del VEE, p. ej., TC-83 (véase, Smith et al, publicación de patente de EE.UU. nº 2005-0266550) .

La presente solicitud describe un método economizador de dosis de una proteína inmunógena necesaria para proporcionar inmunización eficaz de un sujeto, que comprende coadministrar partículas de replicones de alfavirus capaces de expresan la proteína inmunógena junto con la proteína inmunógena. La dosis de las partículas de replicones de alfavirus preferiblemente es al menos 1 x 102, 1 x 103,... [Seguir leyendo]

1. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana que expresan una proteína inmunógena, para usar en la potenciación de la respuesta inmunitaria contra la proteína inmunógena en un sujeto,

en donde las partículas se administran a dicho sujeto simultáneamente con la proteína inmunógena, o en donde las partículas y la proteína inmunógena se administran simultáneamente a dicho sujeto y en el mismo sitio.

2. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 1, en donde la vía de administración es subcutánea, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, gastrointestinal, rectal, vaginal o por la mucosa respiratoria.

3. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 1, en donde la dosis de partículas de replicones de alfavirus es al menos 1 x 104 unidades infecciosas por ml, medido por ensayo en cultivo celular permisivo a alfavirus.

4. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 3, en donde la dosis de partículas de replicones de alfavirus es al menos 1 x 105 unidades infecciosas por ml, medido por ensayo en cultivo celular permisivo a alfavirus; en donde opcionalmente, la dosis de partículas de replicones de alfavirus es al menos 1 x 106 unidades infecciosas por ml, medido por ensayo en cultivos celulares permisivos a alfavirus.

5. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 1, en donde la dosis de proteína inmunógena usada es al menos 3 veces menor que la dosis de dicha proteína inmunógena requerida para proporcionar inmunización eficaz en ausencia de partículas de replicones de alfavirus que expresan dicha proteína inmunógena; en donde, opcionalmente, la dosis de proteína inmunógena usada es al menos 5 veces menor que la dosis de dicha proteína inmunógena requerida para proporcionar inmunización eficaz en ausencia de partículas de replicones de alfavirus que expresan dicha proteína inmunógena.

6. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 1, en donde la respuesta inmunitaria es una respuesta humoral y la potenciación es al menos de 5 veces.

7. Una composición de vacuna que comprende (a) proteína purificada y (b) partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana, capaces de expresar dicha proteína.

8. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 1 o la composición de vacuna de la reivindicación 7, en donde la proteína es una proteína del virus influenza; en donde, opcionalmente, dicha proteína del virus influenza es una hemaglutinina o una neuraminidasa.

9. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 1, en donde la proteína inmunógena es un antígeno proteico extraído de un microorganismo, virus, parásito, tumor o célula tumoral.

10. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 1, en donde la proteína inmunógena se selecciona de una proteína, glicoproteína, lipoproteína, toxina, toxina atenuada, toxina inactivada, virus, antígeno de célula cancerosa, proteína bacteriana o parte de la misma, toxina inactivada u otra proteína bacteriana, proteína fúngica o parte de la misma, hongo atenuado, hongo inactivado, parásito o proteína o parte de la misma, proteína protozoaria o parte de la misma.

11. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 1, en donde la proteína inmunógena procede de sarampión, paperas, rubéola, sarampión, vaccinia, virus del herpes, o en donde la proteína inmunógena se selecciona de toxinas de ántrax (atenuadas) y antígenos de Bacillus anthracis, antígenos de Yersinia pestis, toxina diftérica inactiva de Cor y nebacterium diphtheriae, toxina inactiva de Clostridium botulinum, especies de Chlamydia, Mycobacterium tuberculosis, o en donde la proteína inmunógena es cualquier antígeno de célula tumoral o cancerosa, opcionalmente seleccionado de antígenos HER2 y BRCA1, MART-1/MelanA, gp100, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, [beta]-catenina, MUM-1, Caspasa-8, KIAA0205, HPVE&, SART-1, PRAME, antígenos p15 y p53, antígeno de tumor de Wilms, tirosinasa, antígeno carcinoembrionario (CEA) , antígeno prostático específico (PSA) , antígeno prostático específico de membrana (PSMA) , antígeno de citoblastos prostáticos (PSCA) , aspartil (asparaginil) [beta]-hidroxilasa humana (HAAH) , y EphA2.

12. Partículas de replicones de virus de la encefalitis equina venezolana para el uso de la reivindicación 1, en donde la proteína inmunógena se selecciona de antígenos proteicos de tejidos tumorales y/o células cancerosas, patógenos y parásitos; opcionalmente de bacterias seleccionadas de Vibrio cholerae, Shigella dysenteriae, Salmonellae, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Streptococcus, Cor y nebacterium diphtheriae, Staphylococcus, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, especies de Chlamydia, Mycobacterium tuberculosis; opcionalmente de hongos seleccionados de Candida, Aspergillus; opcionalmente de protozoos seleccionados de Giardia, Amoebae, tripanosomas, Plasmodium falciparium, Toxoplasma gondii,

Cr y ptosporidium, Cr y ptococcus, y toxinas de plantas, animales, dinoflagelados, algas o bacterianas, o en donde la proteína inmunógena es cualquier antígeno de célula tumoral o cancerosa, opcionalmente seleccionado de antígenos HER2 y BRCA1, MART-1/MelanA, gp100, tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, [beta]-catenina, MUM-1, Caspasa-8, KIAA0205, HPVE&, SART-1, PRAME, antígenos p15 y p53, antígeno de tumor de Wilms, tirosinasa, antígeno carcinoembrionario (CEA) , antígeno prostático específico (PSA) , antígeno prostático específico de membrana (PSMA) , antígeno de citoblastos prostáticos (PSCA) , aspartil (asparaginil) [beta]-hidroxilasa humana (HAAH) , y EphA2.