Variantes de la enzima asparaginasa y sus usos.

Una variante de polipéptido de asparaginasa que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia polipeptídica como se expone en SEC ID NO:

3,

en el que la variante tiene una secuencia de aminoácidos que, cuando se alinea con la secuencia expuesta en SEC ID NO: 3, comprende al menos una sustitución de un resto de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos 53, 63, 66 u 88, definiéndose dichas posiciones con referencia a SEC ID NO: 3;

y en el que la variante tiene una actividad específica que es mayor a al menos un pH que la del polipéptido como se expone en SEC ID NO: 3 medida al mismo pH, y/o en el que la variante tiene un óptimo de pH que es mayor que el del polipéptido como se expone en SEC ID NO: 3.

Variantes de la enzima asparaginasa y sus usos Campo de la invención La invención se refiere a variantes de polipéptidos de asparaginasa y a secuencias polinucleotídicas que comprenden genes que codifican estas variantes de asparaginasa. La invención se refiere a un método para identificar variantes adecuadas de asparaginasa. La invención también se refiere a métodos para usar estas proteínas variantes en procedimientos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido según la invención adecuadas para producir estas proteínas y células, en las que una proteína según la invención se modifica genéticamente para potenciar o reducir su actividad y/o nivel de expresión. La invención también se refiere a métodos para usar las variantes de asparaginasa en procedimientos industriales.

Antecedentes de la invención Recientemente, se ha publicado la aparición de acrilamida en un número de productos alimentarios calentados (Tareke et al. Chem. Res. Toxicol. 13, 517-522 (2000) ) . Puesto que la acrilamida es considerada como probablemente carcinogénica para animales y seres humanos, este hallazgo ha dado como resultado una preocupación a nivel mundial. La investigación adicional reveló que son detectables cantidades considerables de acrilamida en una variedad de alimentos habituales cocinados, fritos o preparados en el horno, y se demostró que la aparición de acrilamida en los alimentos fue el resultado del procedimiento de calentamiento.

Una vía para la formación de acrilamida a partir de aminoácidos y azúcares reductores como resultado de la reacción de Maillard se ha propuesto por Mottram et al. Nature 419:448 (2002) . Según esta hipótesis, la acrilamida se puede formar durante la reacción de Maillard. Durante la cocción y el asado, la reacción de Maillard es principalmente responsable del color, olor y sabor. Una reacción asociada con la reacción de Maillard es la degradación de Strecker de aminoácidos, y se ha propuesto una vía hacia la acrilamida. La formación de acrilamida se hizo detectable cuando la temperatura superó 120º C, y se observó la tasa más elevada de formación a alrededor de 170º C. Cuando estaban presentes asparagina y glucosa, se pudieron observar los niveles más elevados de acrilamida, mientras que la glutamina y ácido aspártico sólo dieron como resultado cantidades en trazas.

El límite de migración oficial en la UE para acrilamida que migra al alimento desde plásticos de contacto con alimentos está establecido a 10 ppm (10 microgramos por kilogramo) . Aunque todavía no se ha establecido ningún límite oficial para acrilamida que se forma durante la cocción, el hecho de que un lote de producto supere este valor, especialmente cereales, productos del pan, y productos a base de patata y de maíz, provoca preocupación.

Se sabe que varias materias primas vegetales contienen niveles sustanciales de asparagina. En patatas, la asparagina es el aminoácido libre dominante (940 mg/kg, que corresponde a 40% del contenido total de aminoácidos) , y en harina de trigo, la asparagina está presente como un nivel de alrededor de 167 mg/kg, que corresponde al 14% del conjunto de aminoácidos libres totales (Belitz y Grosch en Food Chemistr y -Springer Nueva York, 1999) . El hecho de que la acrilamida se forma principalmente a partir de asparagina (combinada con azúcares reductores) puede explicar los niveles elevados de acrilamida en productos vegetales fritos, cocinados en el horno o asados. Por lo tanto, en interés de la salud pública, existe la necesidad urgente de productos alimentarios que tengan niveles sustancialmente menores de acrilamida, o, preferiblemente, estén desprovistos de ella.

Se ha propuesto una variedad de soluciones para disminuir el contenido de acrilamida, ya sea alterando las variables del procesamiento, por ejemplo la temperatura o duración de la etapa de calentamiento, o evitando química o enzimáticamente la formación de acrilamida, o eliminando la acrilamida formada.

En varias solicitudes de patente se ha descrito el uso de asparaginasa para disminuir el nivel de asparagina, y de ese modo la cantidad de acrilamida formada. Las asparaginasas adecuadas para este fin se han producido a partir de varias fuentes fúngicas, como por ejemplo Aspergillus niger en el documento WO 2004/030468 y Aspergillus or y zae en el documento WO 04/032648.

Aunque todas las L-asparaginasas catalizan la misma conversión química, esto no significa que son adecuadas para las mismas aplicaciones. Diversas aplicaciones exigirán diferentes demandas en las condiciones en las que las enzimas han de operar. Los parámetros físicos y químicos que pueden influir en la velocidad de una conversión enzimática son la temperatura (que tiene un efecto positivo sobre las velocidades de reacción química, pero puede tener un efecto negativo sobre la estabilidad de la enzima) , el contenido de humedad, el pH, la concentración de sal, la integridad estructural de la matriz alimentaria, la presencia de activadores o inhibidores de la enzima, la concentración del sustrato y productos, etc.

Por lo tanto, existe una necesidad continuada de asparaginasas mejoradas para varias aplicaciones, que tengan propiedades mejoradas.

Objeto de la invención

Es un objeto de la invención proporcionar nuevos polipéptidos variantes de asparaginasa, y polinucleótidos que codifican tales variantes. Un objeto adicional es proporcionar cepas recombinantes que produzcan tales variantes de asparaginasa. También, un método para identificar variantes es parte de la invención, así como métodos para obtener y usar los polinucleótidos y polipéptidos según la invención.

Sumario de la invención La invención proporciona una variante de polipéptido de asparaginasa que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia polipeptídica como se expone en SEC ID NO: 3, que, cuando se alinea con la secuencia expuesta en SEC ID NO: 3, comprende una sustitución de un resto de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos 53, 63, 66 u 88, definiéndose dichas posiciones con referencia a SEC ID NO: 3; y en la que la variante tiene una actividad específica que es mayor a al menos un pH que aquella del polipéptido como se expone en SEC ID NO: 3 medida al mismo pH, y/o en la que la variante tiene un óptimo de pH que es mayor que el del polipéptido como se expone en SEC ID NO: 3.

La invención también proporciona:

-una secuencia de ácido nucleico que codifica tal variante;

-un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante de la invención enlazada operablemente a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de una asparaginasa en un hospedante de expresión adecuado;

-un vector de expresión recombinante que comprende tal constructo de ácido nucleico;

-una célula hospedante recombinante que comprende tal vector de expresión;

-un método para producir una asparaginasa que comprende cultivar tal célula hospedante en condiciones que conduzcan a la producción de la asparaginasa, y recuperar la asparaginasa;

-un método para producir una variante de polipéptido de asparaginasa, método el cual comprende:

a) seleccionar un polipéptido de asparaginasa progenitor que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID NO: 3;

b) sustituir al menos un resto de aminoácido que corresponde a cualquiera de 53, 63, 66 u 88, definiéndose dichas posiciones con referencia a SEC ID NO: 3;

c) sustituir opcionalmente uno o más aminoácidos adicionales como se definen en b) ;

d) preparar la variante que resulta de las etapas a) -c) , en el que la variante tiene al menos 80% de identidad con SEC ID NO: 3;

e) determinar la actividad específica y/o el óptimo de pH de la variante; y

f) seleccionar una variante que tiene una mayor actividad específica y/u óptimo de pH en comparación con el polipéptido de asparaginasa progenitor, para producir de ese modo una variante de polipéptido de asparaginasa.

-una composición que comprende una variante de la invención o una variante obtenida mediante un método de la invención;

-uso de una composición de la invención en la producción de un producto alimentario; y

-uso de una composición de la invención para reducir la cantidad de acrilamida formada en un producto alimentario térmicamente procesado basado en una materia prima que contiene asparagina.

Descripción detallada de la invención A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones que se acompañan, las palabras “comprender” e “incluir”, y variaciones tales... [Seguir leyendo]

1. Una variante de polipéptido de asparaginasa que tiene al menos 80% de identidad con la secuencia polipeptídica como se expone en SEC ID NO: 3,

en el que la variante tiene una secuencia de aminoácidos que, cuando se alinea con la secuencia expuesta en SEC ID NO: 3, comprende al menos una sustitución de un resto de aminoácido que corresponde a cualquiera de los aminoácidos 53, 63, 66 u 88, definiéndose dichas posiciones con referencia a SEC ID NO: 3;

y en el que la variante tiene una actividad específica que es mayor a al menos un pH que la del polipéptido como se expone en SEC ID NO: 3 medida al mismo pH, y/o en el que la variante tiene un óptimo de pH que es mayor que el del polipéptido como se expone en SEC ID NO: 3.

2. Una variante según la reivindicación 1, en la que la variante tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una sustitución de un resto de aminoácido que corresponde a cualquiera de las posiciones 63 u 88, definiéndose dichas posiciones con referencia a SEC ID NO: 3.

3. Una variante según la reivindicación 1 ó 2, en la que la variante tiene una actividad específica que es mayor, a al menos un pH entre pH 4 y pH 8, que la del polipéptido como se expone en SEC ID NO: 3 medida al mismo pH.

4. Una variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la variante tiene una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de Tyr en la posición 53, Gly o Val o Ser en la posición 63, Pro en la posición 66, o Tyr o Pro en la posición 88, definiéndose dichas posiciones con referencia a SEC ID NO: 3.

5. Una variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la variante tiene una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12 o SEC ID NO: 16.

6. Una variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una o más sustituciones de restos de aminoácidos distintas de las definidas en la reivindicación 1.

7. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 enlazada operablemente a una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de una asparaginasa en un hospedante de expresión adecuado.

9. Un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. Una célula hospedante recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 9.

11. Un método para producir una asparaginasa, que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 10 en condiciones que conduzcan a la producción de la asparaginasa, y recuperar la asparaginasa.

12. Un método para producir una variante de polipéptido de asparaginasa, método el cual comprende:

a) seleccionar un polipéptido de asparaginasa progenitor que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID NO: 3;

b) sustituir al menos un resto de aminoácido que corresponde a cualquiera de 53, 63, 66 u 88, definiéndose dichas posiciones con referencia a SEC ID NO: 3;

c) sustituir opcionalmente uno o más aminoácidos adicionales como se definen en b) ;

d) preparar la variante que resulta de las etapas a) -c) , en el que la variante tiene al menos 80% de identidad con SEC ID NO: 3;

e) determinar la actividad específica a al menos un pH, y/o el óptimo de pH de la variante; y

f) seleccionar una variante que tiene una mayor actividad específica a al menos un pH en comparación con el polipéptido de asparaginasa progenitor, y/o un mayor óptimo de pH en comparación con el polipéptido de asparaginasa progenitor, para producir de ese modo una variante de polipéptido de asparaginasa.

13. Un método según la reivindicación 12, en el que, en la etapa b) , se sustituye al menos un resto de aminoácido que corresponde a cualquiera de 63 u 88, definiéndose dichas posiciones con referencia a SEC I D NO: 3.

14. Un método según la reivindicación 12 ó 13, en el que, en la etapa b) , el resto de aminoácido sustituido corresponde a uno o más de Tyr en la posición 53, Gly o Val o Ser en la posición 63, Pro en la posición 66, o Tyr o Pro en la posición 88, definiéndose dichas posiciones con referencia a SEC ID NO: 3.

15. Una composición que comprende la variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la asparaginasa obtenible mediante un método según la reivindicación 11 a 14.

16. Uso de una asparaginasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o de una composición según la reivindicación 15, en la producción de un producto alimentario.

17. Uso de una asparaginasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o de una composición según la reivindicación 15, para reducir la cantidad de acrilamida formada en un producto alimentario procesado térmicamente, basado en una materia prima que contiene asparagina.

18. Procedimiento para la producción de un producto alimentario que implica al menos una etapa de calentamiento, que comprende añadir una o más enzimas asparaginasas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una composición según la reivindicación 15, a una forma intermedia de dicho producto alimentario en dicho procedimiento de producción, con lo que se añade la enzima antes de dicha etapa de calentamiento en una cantidad que es eficaz para reducir el nivel de asparagina que está presente en dicha forma intermedia de dicho producto alimentario.