Vectores pseudotipos LCMV-GP-VSV y células productoras de virus infiltrantes en tumores para el tratamiento de tumores.

Vector pseudotipo VSV-LCMV-GP, en donde el vector pseudotipo comprende un gen que codifica una glicoproteína GP del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) y carece de un gen funcional que codifica la proteína de la envuelta G del VSV y en donde el vector pseudotipo muestra un tropismo por células de glía.

Vectores pseudotipos LCMV-GP-VSV y células productoras de virus Infiltrantes en tumores para el tratamiento de tumores.

La presente Invención se refiere a virus recombinantes derivados de la estomatitis vesicular (VSV) y vectores víricos que comprenden un gen que codifica la glicoproteína GP del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), células empaquetadoras que producen los viriones VSV pseudotipados con GP-LCMV, y el uso de dichos viriones y células empaquetadoras para la preparación de una composición farmacéutica para la terapia de tumores sólidos.

Descripción del estado de la técnica

Los gliomas malignos, el mayor grupo de tumores cerebrales intracraneales primarios, representan un problema terapéutico que no se ha resuelto todavía. Aunque el conocimiento de la biología de estos tumores ha crecido debido a la intensa investigación básica, el progreso y pronóstico clínicos son aún muy malos.

Los gliomas malignos son tumores de origen neuroepitelial y se dividen citológicamente en ependimomas, oligodendrogliomas, oligoastrocitomas, astrocitomas y glioblastomas. Con una proporción de más del 60%, los astrocitomas infiltrantes difusos (grado de la OMS ll-IV) representan el mayor grupo de tumores intracraneales. La clasificación de la OMS revisada en 2001 está en su mayor parte establecida como esquema de clasificación para astrocitomas. Según la OMS, los tumores cerebrales se asignan por medio de criterios histológicos en 4 grados de malignidad (Kleihus y Cavenee, 2000). El pronóstico para astrocitomas infiltrantes difusos es generalmente malo. Por una parte, el pronóstico depende del grado de malignidad y, por otra, de la localización del tumor y el procedimiento de terapia. El índice de supervivencia medio para pacientes con un astrocitoma de grado II de la OMS es de más de 5 años, con un astrocitoma de grado III de la OMS, de 2 a 5 años, y con un astrocitoma-glioblastoma de grado IV de la OMS (= glioblastoma), menos de 1 año.

La patogénesis molecular de tumores es un proceso complejo y se basa en mutaciones de diferentes genes que son responsables del control del ciclo celular. Las mutaciones en el gen supresor tumoral p53 son las alteraciones más frecuentemente encontradas en tumores humanos y también son responsables del desarrollo de astrocitomas de grado bajo así como de la progresión al glioblastoma secundario. Sin embargo, los glioblastomas primarios desarrollados tienen muy raramente mutaciones en p53. Se sospecha que un gen adicional, que indica una tendencia maligna de los astrocitomas difusos, está en el brazo largo del cromosoma 19. Genes adicionales que con frecuencia están alterados en caso de glioblastoma son los oncogenes MDM2 y MDM4 y también el gen supresor tumoral p14ARF, que están implicados en el control del ciclo celular dependiente de p53 (Dai y Holland, 2001). Se observa una amplificación del gen del receptor de EGF en el 30-40% de los glioblastomas primarios y por tanto es el oncogén más frecuentemente amplificado en este grupo de tumores (Holland, 2001). La mayoría de los gliomas malignos responden mal a quimio- o radioterapia. Se asume que la razón para esto son las mutaciones de genes asociados al ciclo celular que también están implicados en la regulación de apoptosis.

Se necesitan urgentemente métodos de terapia más eficaces para gliomas malignos ya que de los métodos de terapia existentes tales como quimio- o radioterapia, no se pueden esperar mejoras significativas para el pronóstico de la enfermedad. En contraste, la terapia génica del glioblastoma ofrece posibilidades prometedoras que se necesita explotar. Se desarrollaron una pluralidad de genes diferentes muy eficaces para este fin. Para la mayoría de ellos, están disponibles datos de experimentos en animales (Shir y Levitzki, 2001). Estos genes terapéuticos se pueden asignar a cuatro principios de actuación diferentes:

(i) El producto génico de los denominados genes suicidas convierte precursores en moléculas citotóxicas. Un

ejemplo es la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple (HSV) en relación con una dosis de ganciclovir. Una ventaja particular es que el trifosfato de ganciclovir tóxico difunde a células adyacentes, por cual tiene un lugar un efecto espectador. En los últimos años, la actividad de esta enzima ha aumentado adicionalmente. TK de HSV es actualmente una posibilidad muy eficaz para eliminar células tumorales así como células productoras de vector implantadas.

(ii) La expresión de citoquinas inmunoestimuladoras tales como IL-4 puede estimular la defensa natural contra

células tumorales.

(iii) La secreción de proteínas antiangiogénicas tales como la endostatina produce una falta de vasos

sanguíneos y por tanto una falta de suministro de nutrientes en el tejido tumoral metabólicamente muy activo. El tumor muere virtualmente "de hambre".

(iv) Por último, se han descrito una serie de genes que intervienen en la transducción de señales o el ciclo

celular de la célula tumoral para inhibir el crecimiento incontrolado de estas células. Sin embargo, las posibilidades de uso de estos genes en clínica están limitados porque estos genes actúan solo en la célula genéticamente modificada misma y no tienen el efecto espectador como los principios activos mencionados primero. Esto significa que para alcanzar un efecto terapéutico, virtualmente todas las células malignas tienen que estar genéticamente modificadas lo que es imposible incluso con sistemas de vectores ideales.

Gracias a la variedad de principios de acción eficaces existentes, se cumple el prerrequisito más importante para una terapia génica con éxito del glioblastoma. Sin embargo, un problema que aún no se ha resuelto es la transferencia génica ineficaz y una mala expresión del gen terapéutico en las células diana. Esto también es la razón por la que, a pesar de la multitud de genes terapéuticos eficaces, la terapia génica de glioblastoma fracasara en la clínica.

La ventaja de la transferencia génica vírica sobre los métodos de transfección fisicoquímicos es la mayor tasa de transferencia génica y la expresión a largo plazo de los genes porque los virus han desarrollado mecanismos particularmente eficaces para introducir su genoma en células y expresarlo. En particular virus competentes para replicación tales como, entre otros, virus del herpes simple (HSV), adenovirus (Ad), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) y el virus de la estomatitis vesicular (VSV) se usan actualmente como virus oncolíticos (VO). Para una viroterapia óptima de glioblastomas, los VO deben tener las siguientes características:

(i) Deben tener un tropismo específico de tumor, por lo cual la replicación del virus y la lisis celular

permanecen limitadas al tejido tumoral. Esta propiedad se puede aumentar por modificación de la envuelta vírica o usando promotores específicos de tumores. Puesto que la asunción es que solo una pequeña parte de las células del glioma se divide durante el tratamiento, los virus que infectan las células en reposo así como las células en proliferación son ventajosos.

(ii) Con respecto a aspectos relevantes de seguridad, los virus con alta estabilidad genética y una baja

toxicidad fuera del tejido tumoral son particularmente adecuados para el uso clínico. Esto permite un título de virus alto y una purificación de los vectores bajo condiciones GMP. Idealmente, los VO deben ser apatogénicos para seres humanos y deben tener un bajo índice de infección entre la población. Una inmunidad ya existente produciría una neutralización prematura del virus y por tanto no permitiría una terapia eficaz.

Los ejemplos prominentes para virus oncolíticos en la terapia de glioblastomas son las variantes atenuadas de HSV G207 y 1716 y el adenovirus ONYX-015. Una objeción seria contra el uso de HSV oncolítico para el tratamiento de tumores en el SNC es su alto nivel de replicación en células cerebrales normales lo que puede producir una encefalitis potencialmente mortal. Por otra parte, además de la potencial persistencia, existe la posibilidad de reactivación de un HSV latente. La vahante de HSV 1716, que se generó delecionando una pluralidad de genes, se replica selectivamente en células que proliferan rápidamente del SNC pero no en neuronas posmitóticas. Debido a eso, la neurotoxicidad de HSV se redujo significativamente. El tratamiento de gliomas experimentales en la rata y el ratón con HSV 1716 produjo la destrucción selectiva de células tumorales mientras que el tejido cerebral circundante permaneció sin dañar. ONYX-015 es un virus oncolítico adicional que se desarrolló para terapia de glioblastoma. Mediante una deleción en el gen E1B, se pretende que... [Seguir leyendo]

1. Vector pseudotipo VSV-LCMV-GP, en donde el vector pseudotipo comprende un gen que codifica una glicoproteína GP del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) y carece de un gen funcional que codifica la 5 proteína de la envuelta G del VSV y en donde el vector pseudotipo muestra un tropismo por células de glía.

2. El vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según la reivindicación 1, en donde la proteína de la envuelta G de VSV se sustituye por la glicoproteína GP de LCMV.

3. El vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la glicoproteína GP de LMCV tiene un tropismo por células de glioblastoma.

4. El vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el LCMV se selecciona del grupo que consiste en LCMV-WE, LCMV-WE-HPI y LCMV-WE HPlopt. 15

5. El vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína M del VSV comprende mutaciones que reducen la citopatogenicidad del VSV.

6. El vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el vector 20 pseudotipo comprende al menos un transgén.

7. El vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según la reivindicación 6, en donde el transgén codifica una proteína suicida, una proteína inmunoestimuladora o una proteína marcadora.

8. El vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según la reivindicación 7, en donde la proteína suicida es la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK) , citosina desaminasa, FKBP-FAS o FKBP-caspasa9.

9. El vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según la reivindicación 7, en donde la proteína inmunoestimuladora es IL-2, IL-4, IL-12, anti-TGFbeta neutralizante o Flt3L. 30

10. Sistema de vectores pseudotipo VSV-LCMV-GP, en donde el sistema de vectores pseudotipo comprende al menos dos vectores VSV complementarios replicativos, en donde el sistema comprende los genes n, l, p y m que codifican las proteínas N, L, P y M de VSV, un gen gp que codifica una glicoproteína GP de LCMV y carece de un gen funcional que codifica la proteína de la envuelta G de VSV, en donde cada vector del 35 sistema carece de uno de los genes n, l, p, m y gp, y en donde el gen que falta está presente en cualquier otro vector del sistema y en donde el LCMV se selecciona del grupo LCMV-WE, LCMV-WE-HPI y LCMV-WE HPlopt.

11. El sistema de vectores pseudotipo VSV-LCMV-GP según la reivindicación 10, en donde la proteína M del VSV 40 comprende al menos una mutación que reduce la citopatogenicidad del VSV.

12. El sistema de vectores pseudotipo VSV-LCMV-GP según la reivindicación 10 o 11, en donde el sistema de vectores pseudotipo comprende al menos un transgén.

13. Virión VSV pseudotipado, en donde el virión VSV comprende una glicoproteína GP de un LCMV seleccionado del grupo LCMV-WE, LCMV-WE-HPI y LCMV-WE HPlopt como proteína de envuelta.

14. Célula productora de virus, en donde la célula productora de virus produce un virión VSV pseudotipado de la reivindicación 13. 50

15. La célula productora de virus según la reivindicación 14, en donde la célula productora de virus es una célula madre adulta.

16. La célula productora de virus según la reivindicación 15, en donde la célula madre adulta es una célula 55 progenitora adulta multipotente (MAPC) , un célula madre neural (NSC) , una célula madre mesenquimatosa (MSC) o una célula BM-TIC (célula infiltrante en tumor derivada de médula ósea) .

17. La célula productora de virus según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde la célula productora de virus comprende uno o más casetes de expresión para la expresión de al menos uno de los genes del 60 grupo que consiste en los genes n, l, p y m que codifican las proteínas N, L, P y M de VSV y un gen gp que codifica la glicoproteína GP de LCMV.

18. La célula productora de virus según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde la célula productora de virus comprende un vector de transferencia génica para el empaquetamiento en un virión VSV 65 pseudotipado con LCMV-GP, en donde el vector de transferencia génica comprende un transgén.

19. La célula productora de virus según la reivindicación 18, en donde el transgén es un gen que codifica una proteína suicida, una proteína inmunoestimuladora o una proteína marcadora.

20. Método para la transferencia de un transgén en una célula in vitro, en donde la célula se transduce con un 5 virión VSV pseudotipado según la reivindicación 13, en donde el virión comprende un transgén.

21. Método para la transferencia de un transgén en una célula in vitro, en donde la célula se pone en contacto con una célula productora de virus según la reivindicación 18 o 19.

22. El método según la reivindicación 20 o 21, en donde la célula es una célula tumoral.

23. Uso de un vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un sistema de vectores pseudotipo VSV-LCMV-GP según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, un virión VSV pseudotipado según la reivindicación 13 o una célula productora de virus según cualquiera de las 15 reivindicaciones 14 a 19, para la producción de una composición farmacéutica para la terapia de un tumor sólido.

24. Uso según la reivindicación 23, en donde el tumor es un tumor cerebral.

25. Uso según la reivindicación 24, en donde el tumor es un tumor cerebral maligno.

26. Composición farmacéutica, en donde la composición comprende un vector pseudotipo VSV-LCMV-GP según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un sistema de vectores pseudotipo VSV-LCMV-GP según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, un virión VSV pseudotipado según la reivindicación 13 o una célula productora 25 según virus de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19.