Método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada.

Un método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada,

que comprende: obtener una muestra archivada que comprende ADN y parafina y opcionalmente un agente de fijación;

(a) someter la muestra archivada directamente a una etapa de lisis con una proteasa, en donde la parafina es licuada por calentamiento para proveer una cantidad de ADN tratado con proteasa accesible;

(b) inactivar la proteasa mediante calor, adición de un inhibidor de proteasa, o ambos; y

(c) tratar el ADN con un reactivo de bisulfito sin una etapa previa de extracción de ADN.

Método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada Campo de la invención La invención se relaciona en general con un método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada que comprende parafina, y para los análisis de la misma.

Adicionalmente, la divulgación se relaciona en general con composiciones y métodos para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada (por ejemplo, biopsias de tejido embebidas en parafina y/o fijadas, etc.) , y para análisis de la misma.

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Serie No. 60/614, 697, presentada el 30 de septiembre de 2004, y titulada "Flujo de trabajo".

Antecedentes Las muestras o biopsias son archivadas muchas veces de forma predeterminada en rutinas de diagnóstico. Esto se hace con el fin de conservar el tejido y para prepararlo para exámenes histológicos subsecuentes. Tal conservación es necesaria para asegurar que la biopsia no haya cambiado después de su remoción, y que los hallazgos observados correspondan con la situación del paciente, y para evitar la degradación de las estructuras celulares. De acuerdo con lo anterior, la muestra de tejido es colocada inmediatamente en un fijador por ejemplo formalina después de la remoción. Después de la fijación la muestra es embebida en parafina, lo cual permite un seccionamiento del tejido y un subsecuente examen histológico adicional.

Usando estos procedimientos, las biopsias son tomadas rutinariamente de pacientes para diagnóstico de enfermedades y/o para estudiar el patrón de marcadores asociados con las enfermedades. Durante las últimas décadas millones de biopsias fueron recolectadas, archivadas y almacenadas de esta manera. Estas muestras representan un recurso principal para la detección o análisis de alteraciones asociadas con trastornos o enfermedades. Por lo tanto estas muestras son invaluables, puesto que permiten la evaluación de indicadores de diagnóstico y/o prognosis en recolecciones retrospectivas.

Pero desafortunadamente, este recurso es accesible solamente de manera mínima por los medios biológicos moleculares, en particular por los métodos más prometedores y modernos tales como aquellos para el análisis del patrón de metilación. Esto se debe a las dificultades en obtener cantidades suficientemente grandes de ADN genómico de alta calidad y bajo coste y con mínimo esfuerzo de manipulación.

Estas dificultades se basan en la degradación del ADN y del ARN debido a las condiciones de fijación y almacenamiento de la muestra o biopsia, y en los métodos insuficientes para la preparación del ADN. Para preservar las estructuras morfológicas en la muestra tanto como sea posible, las biopsias se fijan usualmente muy bien. Esto tiene la desventaja de que una alta cantidad de proteínas están enlazadas covalentemente al ADN genómico y también el ADN genómico se entrecruza. Consecuentemente, el ADN genómico tiende a ser de tamaño de fragmento pequeño, tiene una baja integridad, y es contaminado por proteínas, péptidos y/o aminoácidos los cuales están entrecruzados con el ADN e interfieren con el análisis posterior.

La mayor parte de los métodos del arte anterior para el aislamiento del ADN de los tejidos embebidos en parafina fijados con formalina se basan en los métodos de aislamiento de ADN a partir de tejido fresco. Se llevan a cabo de la misma forma en que una persona experimentada en la técnica trataría las muestras frescas quizás con una etapa adicional de remoción de parafina. Como es bien sabido, tal procedimiento lleva solamente a rendimientos comparativamente bajos de ADN genómico, teniendo el ADN sólo una pequeña longitud de fragmento. Adicionalmente, el ADN tampoco es adecuado para métodos de análisis más sofisticados, porque todavía hay una cantidad de proteínas, péptidos y/o aminoácidos interferentes enlazados al ADN.

Se conocen métodos particulares "mejorados" en el arte. Por ejemplo la US 6, 248, 535 enseña un método para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina. De acuerdo con este método, la muestra se desparafiniza, homogenizada antes de ser calentada en una solución caotrópico. Después de mezclar con cloroformo, después de la centrifugación, la solución tiene tres fases. La interfase contiene el ADN genómico.

Se describe un método diferente en GB 2369822. De acuerdo con esta, se colocan secciones de una muestra embebida en parafina fijada con formalina en un tubo. Se agrega un detergente, una cera y una enzima digestora de tejido, antes de que el tubo sea calentado hasta aproximadamente 60º C durante aproximadamente 30 minutos. Después de esto la enzima es inactivada por un incremento de temperatura hasta 96º C. Una etapa de centrifugación subsecuente lleva a una formación de capas dentro del tubo, conteniendo la capa media el ADN genómico así como el ARN.

Tales métodos llevan usualmente a grandes cantidades de ADN genómico con una cantidad importante de ARN y proteína de contaminantes. Además, los contaminantes no pueden ser removidos fácilmente porque están entrecruzados con el ADN genómico por el fijador. Además, en principio, puede ser posible también aislar fragmentos de ácido nucleico más largos con esta clase de métodos, pero la porción de fragmentos largos es muy pequeña.

Se han hecho varias propuestas para obtener fragmentos más largos: Bonin et al. enseña una exposición de una escisión de cadena sencilla después del aislamiento del ADN y una etapa de desnaturalización antes de la amplificación por PCR (Bonin S., Petrera, F., Niccolini, B., Stanta, G. (2003) J. Clin Pathol:. Mol. Pathol. 56, 184-186) . De acuerdo con este método son amplificables fragmentos de hasta 300 bp.

Inadome et al. sugiere el aislamiento de la porción de fragmentos de ADN más largos por HPLC (Inadome, Y., Noguchi, M. (2003) Diagn. Mol. Pathol 12, 231-236) . Este procedimiento lleva sólo a rendimientos muy bajos de ADN.

Para agrandar la cantidad de fragmentos de ADN largos aislada a partir de tejidos embebidos en parafina, fijados con formalina, Tie et al. y Siwoski et al. sugirieron una amplificación de genoma completo, (Tie, J., Serizawa, Y., Oshida, S., Usami, R., Yoshida Y. (2005) Pathol. Int. 55, 343-347; Siwoski, A., Ishkanian, A., Garnis, C., Zhang, L., Rosin, M., Lam, W.L. (2002) Mod. Pathol. 15, 889-892.) . Esta solución tiene la desventaja de una baja reproducibilidad y no es aplicable cuando el ADN va a ser analizado para metilación puesto que la amplificación borra las señales de metilación.

Consecuentemente, el ADN genómico aislado de acuerdo con métodos de la técnica anterior no es adecuado para el análisis del patrón de metilación como se explica en detalle a continuación.

La importancia del análisis del patrón de metilación de ADN ha sido revelada en años recientes. Muchas enfermedades, en particular enfermedades cancerosas, están acompañadas por expresión genética modificada. Esta puede ser una mutación de los genes en sí mismos, la cual lleva a una expresión de proteínas modificadas o a una inhibición o sobreexpresión de las proteínas o enzimas. Una modulación de la expresión sin embargo puede presentarse por modificaciones epigenéticas, en particular, por cambios en el patrón de metilación de ADN. Tales modificaciones epigenéticas no afectan la secuencia de codificación real del ADN. Se ha encontrado que los procesos de metilación de ADN tienen implicaciones sustanciales para la salud, y parece ser claro que el conocimiento acerca de los procesos de metilación y modificaciones del metabolismo de metilo y metilación de ADN son esenciales para el entendimiento de las enfermedades, para la profilaxis, diagnóstico y terapia de las enfermedades.

El control preciso de los genes, el cual representa una pequeña parte solamente del genoma completo de los mamíferos, involucra la regulación en consideración del hecho de que la parte principal del ADN en el genoma no es codificante. La presencia de tales intrones que contienen ADN “troncal”, elementos repetitivos y potencialmente elementos activamente transponibles, requiere mecanismos efectivos para su supresión durable (silenciamiento) . Aparentemente, la metilación de citosina por ADN metil transferasas dependientes de S-adenosilmetionina (SAM) , las cuales forman 5-metilcitosina, representa un mecanismo tal para la modificación de interacciones ADN-proteína. Los genes pueden ser transcritos por promotores libres de metilación, incluso cuando regiones adyacentes transcritas o no transcritas son ampliamente metiladas. Esto permite... [Seguir leyendo]

1. Un método para proveer fragmentos de ADN derivados de una muestra archivada, que comprende: obtener una muestra archivada que comprende ADN y parafina y opcionalmente un agente de fijación;

(a) someter la muestra archivada directamente a una etapa de lisis con una proteasa, en donde la parafina es licuada por calentamiento para proveer una cantidad de ADN tratado con proteasa accesible;

(b) inactivar la proteasa mediante calor, adición de un inhibidor de proteasa, o ambos; y

(c) tratar el ADN con un reactivo de bisulfito sin una etapa previa de extracción de ADN.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende purificar el ADN tratado con bisulfito utilizando un método de purificación de ADN adecuado.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente la etapa de amplificar el ADN.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la proteasa es seleccionada del grupo consistente de una serina proteasa, una tiol proteasa, una carboxi proteasa, una metaloproteasa, proteinasa K y combinaciones de estas proteasas.

5. El método de la reivindicación 2, en donde la purificación del ADN comprende el enlazamiento del ADN a superficies de sílica, o a membranas de sílica.

6. El método de la reivindicación 3, en donde la purificación de ADN se lleva a cabo por medio de ultrafiltración o partículas magnéticas.

7. El método de la reivindicación 3, en donde la amplificación del ADN comprende detectar al menos una posición que está metilada en el ADN genómico de la muestra archivada, al menos una posición que no está metilada en el ADN genómico de la muestra archivada, o ambas.

8. El método de la reivindicación 3, en donde la amplificación del ADN comprende el uso de al menos un método seleccionado del grupo consistente de: el método PCR; el método de secuenciación por bisulfito; el método COBRA; el método Ms-SNuPE (Extensión de Cebador de Nucleótido Individual Sensible a Metilación) ; el método MSP (PCR específico para metilación) ; el método MSP anidado; el método HeavyMetil™; el método MetiLight™; y el ensayo QM.

9. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra archivada consiste de 1-6 secciones de 10 micrómetros de espesor con un área de tejido en el rango de 0.7 cm x 0.7 cm a 2.5 cm x 3.5 cm.

10. Uso del método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para la detección del estado de metilación de ADN.

11. Uso de un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para identificar las posiciones CpG con un estado de metilación específico de una enfermedad, en donde

a) se prepara el ADN de una muestra archivada originada de un tejido enfermo y se determina el estado de metilación del ADN;

b) se prepara el ADN de una muestra originada de un tejido saludable y se determina el estado de metilación del ADN;

y

c) se define un objetivo específico de la indicación con base en las diferencias en el estado de metilación del ADN del ADN derivado del tejido enfermo en comparación con el ADN derivado del tejido sano.

12. Uso del método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para diagnóstico, prognosis o ambas de efectos adversos para pacientes o individuos, en donde los efectos adversos comprenden al menos una categoría seleccionada del grupo consistente de: interacciones indeseadas entre fármacos; enfermedades cancerosas; disfunciones, daño o enfermedad del CNS;; síntomas de agresión o perturbaciones de comportamiento; consecuencias clínicas, sicológicas y sociales de daños en el cerebro; perturbaciones psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; enfermedad, disfunción o daños cardiovasculares, disfunción, daños o enfermedad del tracto gastrointestinal; disfunción, daño o enfermedad del sistema respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o

convalecencia; disfunción, daño o enfermedad del cuerpo tal como una anormalidad en el proceso de desarrollo; disfunción, daño o enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conectivo o de los huesos; disfunción, daño o enfermedad endocrina y metabólica; y dolores de cabeza o disfunción sexual.

13. Uso del método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para distinguir tipos de células o tejido o para investigar la diferenciación celular.