N-Óxidos de derivados de n-fenil-2-pirimidinamina.

4-[(4-Metil-1-piperazinil)-metil]-N-[4-metil-3-[[4-(1-óxido-3-piridinil)-2-pirimidinil]-amino]-fenil]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

N-Óxidos de derivados de n-fenil-2-pirimidinamina

La invención se refiere a [(4-metil-4-1 -piperazinil)-metil]-A/-[4-metil-3-[[4-(1 -óxido-3-piridinil)-2-pirimidinil]-amino]-fenil]- benzamida y a una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y a composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos.

Las sales se forman, por ejemplo, como sales de adición de ácidos, preferiblemente con ácidos orgánicos o inorgánicos, a partir de 4-[(4-metil-4-1 -piperazinil)-metil]-A/-[4-metil-3-[[4-( 1 -óxido-3-piridinil)-2-pirimidinil]-amino]- fenilj-benzamida, especialmente las sales farmacéuticamente aceptables.

Con propósitos de aislamiento o purificación, también es posible usar sales farmacéuticamente inaceptables, por ejemplo picratos o percloratos. Solo las sales farmacéuticamente aceptables o los compuestos libres (si se da la ocasión, en la forma de composiciones farmacéuticas) alcanzan un uso terapéutico y, por lo tanto, estos se prefieren.

En vista de la estrecha relación entre los nuevos compuestos en forma libre y en forma de sus sales, incluyendo las sales que pueden usarse como productos intermedios, por ejemplo en la purificación o la identificación de los nuevos compuestos, ha de entenderse anteriormente y posteriormente en la presente memoria que cualquier referencia al compuesto libre se refiere también a las sales correspondientes, según sea apropiado y conveniente.

La 4-[(4-metil-1 -piperazinil)-metil]-N-[4-metil-3-[[4-( 1 -óxido-3-piridinil)-2-pi rimidinilj-aminoj-fenilj-benzamida posee propiedades farmacológicas valiosas y puede usarse, por ejemplo, como un agente antitumoral, como un agente para tratar la aterosclerosis, como un agente para tratar la reestenosis, como un agente antileucémico para la prevención de trastornos inducidos por trasplantes, tales como bronquiolitis obliterante, y/o para prevenir la invasión de células de animales de sangre caliente por ciertas bacterias, tales como Porphyromonas gingivalis.

La fosforilación de proteínas se conoce desde hace mucho como una etapa esencial en la diferenciación y la división de células. La fosforilación es catalizada por proteína quinasas subdivididas en serina/treonina y tirosina quinasas. Las tirosina quinasas incluyen tirosina quinasa receptora de PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas).

El PDGF es un factor de crecimiento muy comúnmente presente, que representa un papel importante tanto en el crecimiento normal como también en la proliferación celular patológica, tal como se observa en la carcinogénesis y en enfermedades de las células del músculo liso de los vasos sanguíneos, por ejemplo en la aterosclerosis y la trombosis.

La inhibición de la actividad de tirosina quinasa receptora estimulada por PDGF in vitro se mide en complejos inmunitarios receptores de PDGF de células A431, según se describe por E. Andrejauskas-Buchdunger y U. Regenass en Cáncer Research 52, 5353-5358 (1992). La 4-[(4-metil-1-piperazinil)-metil]-N-[4-metil-3-[[4-(1-óxido-3- piridinil)-2-pirimidinil]-amino]-fenil]-benzamida inhibe la fosforilación de receptor acelular dependiente de PDGF. La inhibición de tirosina quinasa receptora de PDGF se mide en un ensayo de ELISA de microvaloración (cfr. Trinks y otros, J. Med. Chem. 37, 1015-27 (1994).

La inhibición de tirosina quinasa receptora de PDGF hace a 4-[(4-metil-1-piperazinil)-metil]-N-[4-metil-3-[[4-(1-óxido- 3-piridinil)-2-pirimidinil]-amino]-fenil]-benzamida también adecuada para el tratamiento de enfermedades tumorales, tales como gliomas, sarcomas, tumores de próstata y tumores de colon, mama y ova-rio.

[(4-Metil-1-piperazinil)-metil]-A/-[4-metil-3-[[4-(1-óxido-3-piridinil)-2-pirimidinil]-amino]-fenil]-benzamida también inhibe procesos celulares que implican el llamado factor de células pluripotenciales (SCF, también conocido como el ligando c-Kit o factor "Steel"), tal como la autofosforilación del receptor de SCF (Kit) y la actividad estimulada por SCF de quinasa MAPK (proteína quinasa activada por mitógeno).

En particular, 4-[(4-metil-1-piperazinil)-metil]-N-[4-metil-3-[[4-(1-óxido-3-piridinil)-2-pirimidinil]-amino]-fenil]-benzamida inhibe la actividad de tirosina quinasa de c-Kit. Esto puede observarse en un ensayo de inhibición de tirosina quinasa usando el dominio de quinasa citoplásmico de c-Kit. El ensayo se realiza como sigue: El vector donante de baculovirus pFbacGOl (GIBCO) se usa para generar un baculovirus recombinante que expresa la región de aminoácidos aminoácidos 544-976 de los dominios de quinasa citoplásmicos de c-Kit humano. Las secuencias de codificación para el dominio citoplásmico de c-Kit se amplifican mediante PCR a partir de una biblioteca de c-DNA de útero humano (Clontech). El fragmento de DNA amplificado y el vector pFbacGOl se hacen compatibles para la ligación mediante digestión con BamPII y EcoRI. La ligación de estos fragmentos de DNA da como resultado el plásmido donante de baculovirus c-Kit. La producción de los virus, la expresión de proteínas en células Sf9 y la purificación de las proteínas fusionadas a GST se realizan como sigue:

Producción de virus: Vector de transferencia (pFbacG01-c-Kit) que contiene el dominio de quinasa de c-Kitse transfiere a la línea celular DHIOBac (GIBCO) y las células transfectadas se cultivan en placa sobre placas de agar selectivas. Las colonias sin inserción de la secuencia de fusión en el genoma viral (soportadas por las bacterias) son azules. Las colonias blancas simples se recogen y el DNA viral (bácmldo) se aísla de las bacterias mediante procedimientos de purificación de plásmidos estándar. Células Sf9 o Sf21 (American Type Culture Collection) se transfectan a continuación en matraces de 25 cm con el DNA viral usando reactivo Cellfectin.

Determinación de la expresión de proteínas a pequeña escala en células Sf9: Medio que contiene virus se recoge del cultivo celular transfectado y se usa para la infección para incrementar su concentración. Medio que contiene virus obtenido después de dos rondas de infección se usa para la expresión de proteínas a gran escala. Para la expresión de proteínas a gran escala, placas de cultivo tisular redondas de 100 cm2 se siembran con 5 x 107 células/placa y se infectan con 1 mi de medio que contiene virus (aproximadamente 5 MOIs). Después de 3 días las células se rascan de la placa y se centrifugan a 500 rpm durante 5 min. Las pellas de células de 10-20 placas de 100 cm2 se resuspenden en 50 mi de tampón de llsls (Trls-HCI 25 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, NP-40 al 1%, DTT 1 mM, PMSF 1 mM) enfriado con hielo. Las células se agitan sobre hielo durante 15 min y a continuación se centrifugan a 5000 rpm durante 20 min.

Purificación de proteína etiquetada con GST. El lisado celular centrifugado se carga en una columna de glutationa-Sepharose de 2 mi (Pharmacia) y se lava tres veces con 10 mi de Trls-HCI 25 mM, pH 7,5, EDTA 2 mM, DTT 1 mM, NaCI 200 mM. La proteína etiquetada con GST se eluye mediante 10 aplicaciones (1 mi cada una) de Tris-HCI 25 mM, pH 7,5, glutationa reducida 10 mM, NaCI 100 mM, DTT 1 mM, glicerol al 10%, y se almacena a -70°C.

Ensayo de quinasa: Los ensayos de tirosina proteína quinasa con GST-c-KIt purificada se llevan a cabo en un volumen final de 30 pl que contiene 200-1800 ng de proteína de enzima (dependiendo de la actividad específica), Tris-HCI 20 mM, pH 7,6, MnCh 3 mM, MgCh 3 mM, DTT 1 mM, Na3VC>4 10 pM, 5 pg/ml de poli(Glu, Tyr) 4:1, DMSO al 1%, ATP 1,0 pM y [y33P] ATP 0,1 pCI. La actividad se ensaya en presencia o ausencia de inhibidores, midiendo la incorporación de 33P desde [y33P]ATP en el sustrato de poll(Glu, Tyr) 4:1. El ensayo (30 pl) se lleva a cabo en placas de 96 pocilios a temperatura ambiente durante 20 min bajo condiciones descritas posteriormente y se termina mediante la adición de 20 pl de EDTA 125 mM. Subsiguientemente, 40 pl de la mezcla de reacción se transfieren a membrana Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, EE.UU. de A.) previamente embebida durante 5 min con metanol, enjuagada con agua, a continuación embebida durante 5 min con H3PO4 al 0,5% y montada en una tubería de vacío con la fuente de vacío desconectada. Después de añadir por gotas todas las muestras, el vacío se conecta y cada pocilio se enjuaga con 20 pl de H3PO4 al 0,5%. Las membranas se retiran y se lavan 4 veces en un agitador con H3PO4 al 1,0% y una vez con etanol.

Las membranas se cuentan después del secado a temperatura ambiente, montando en un bastidor de 96 pocilios TopCount de Packard, y la adición de 10 pl/pocillo de Microscint TM (Packard). Los valores de IC50 se calculan mediante análisis de regresión lineal del porcentaje de inhibición de cada compuesto por duplicado, a cuatro concentraciones (habitualmente 0,01, 0,1, 1 y 10 pM).... [Seguir leyendo]

1. 4-[(4-Metil-1-piperazinil)-metil]-W-[4-metil-3-[[4-(1-óxido-3-piridinil)-2-pirimidinil]-amino]-fenil]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

2. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal 5 farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.