Procedimientos de producción de 3-O-desacil-4''-monofosforil lípido A (3D-MLA).

Un procedimiento de extraer lipopolisacárido (LPS) de un cultivo de células de cepa bacteriana mutante rugosa profunda,

que comprende:

a. extraer las células con una solución que consiste esencialmente en al menos el 75 % en peso de un alcohol alifático que tiene de 1 a 4 átomos de carbono y en el agua del resto; produciendo de este modo células con contenido fosfolipídico reducido;

b. extraer las células con contenido fosfolipídico reducido con una solución que comprende cloroformo y metanol, produciendo de este modo una solución de LPS en cloroformo y metanol,

en el que la extracción con alcohol alifático se lleva a cabo a una temperatura entre 35 ºC y 65 ºC.

Procedimientos de producción de 3-0-desacil-4'-monofosforil lípido A (3D-MLA)

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al campo de la producción biosintética de 3-0-desacil-4'-monofosforil lípido A (3D-MLA). Más particularmente, se refiere a procedimientos de mejora del rendimiento de congéneres de 3D- MLA deseados o de minimización del coste de purificación de precursores de lipopolisacáridos (LPS) de 3D-MLA.

2. Descripción de técnica relacionada

Desde hace tiempo se reconoce que los lipopolisacáridos enterobacterianos (LPS) son potentes estimulantes del sistema inmunitario. Puede provocarse una variedad de respuestas, tanto beneficiosas como perjudiciales, por cantidades submicrográmicas de LPS. El hecho de que algunas de las respuestas sean perjudiciales y algunas de estas puedan ser mortales, ha descartado el uso clínico de LPS por sí mismo. Se ha observado que el componente de LPS más responsable de la actividad endotóxica es el lípido A.

Por consiguiente, se ha hecho un gran esfuerzo por atenuar los atributos tóxicos de LPS o lípido A sin disminuir los beneficios inmunoestimulantes de estos compuestos. Entre estos esfuerzos fueron notables los de Edgar Ribi y sus colaboradores, que dieron como resultado la producción del derivado de lípido A 3-0-desacil-4'-monofosforil-lípido A (3D-MLA; composiciones que comprenden 3D-MLA están comercialmente disponibles con el nombre comercial MPL® de Corixa Corporation (Seattle, WA)). 3D-MLA ha mostrado que tiene esencialmente las mismas propiedades inmunoestimulantes que el lípido A pero menor endotoxicidad (Myers y col., patente de EE.UU. n.2:4.912.094). Myers y col. también informaron de un procedimiento para la producción de 3D-MLA, como sigue. Primero, LPS o lípido A obtenido de una cepa mutante rugosa profunda de una bacteria gram-negativa (por ejemplo, R595 de Salmonella minnesota) se somete a reflujo en soluciones de ácidos minerales de fuerza moderada (por ejemplo, HCI 0,1 N) durante un periodo de aproximadamente 30 min. Esto conduce a la desfosforilación en la posición 1 de la glucosamina del extremo reductor y a la descarbohidratación en la posición 6' de la glucosamina no reductora del lípido A. Segundo, el lípido A descarbohidratado desfosforilado (también conocido como monofosforil lípido A o MLA) se somete a una hidrólisis básica, por ejemplo, disolviendo en un disolvente orgánico tal como cloroformo:metanol (CM) 2:1 (v/v), saturando la solución con una solución acuosa de Na2CC>3 0,5 M a pH 10,5 y evaporando al vacío el disolvente. Esto conduce a eliminación selectiva del resto ácido (3-hidroximirístico en la posición 3 del lípido A, resultando 3-O-desacil- 4'-monofosforil-lípido A (3D-MLA).

La calidad del 3D-MLA producido mediante el procedimiento anterior es altamente dependiente de la pureza y composición de los LPS obtenidos de la bacteria gram-negativa. Por citar un ejemplo, el componente de lípido A de LPS es una mezcla de especies estrechamente relacionadas que contienen entre aproximadamente 5-7 restos de ácido graso. En la formación de 3D-MLA, como es evidente de la discusión anterior, un resto de ácido graso se elimina, produciendo 3D-MLA con entre aproximadamente 4-6 restos de ácidos grasos. Se mantiene generalmente que 3D- MLA con al menos 6 restos de ácido graso se prefiere en términos de la combinación de beneficios inmunoestimulantes mantenidos o potenciados, toxicidad reducida y otras propiedades deseables (Qureshi y Takayama, en "The Bacteria," vol. XI (Iglewski y Clark, eds.), Academic Press, 1990, pág. 319-338).

Por citar otro ejemplo, la extracción a escala comercial de LPS de bacterias gram-negativas normalmente implica el procedimiento de Chen (Chen y col., J. Infect. Dis. 128:543 (1973)); concretamente, la extracción con CM, que conduce a una fase de CM rica en LPS y fosfolípidos de la que luego puede purificarse LPS. Sin embargo, la purificación de LPS a partir de la fase de CM rica en LPS y fosfolípidos normalmente requiere múltiples etapas de precipitación para obtener LPS de suficiente pureza para usar en aplicaciones inmunoestimulantes tales como, por ejemplo, uso como adyuvante de vacuna.

Por tanto, sería deseable disponer de procedimientos para preparar convenientemente composiciones de LPS altamente puras. Además, sería deseable disponer de procedimientos para generar composiciones de LPS cuyas composiciones tuvieran 3D-MLA con niveles elevados de congéneres de hexaacilo.

Se han usado técnicas de fermentación conocidas para preparar cultivos de bacterias gram-negativas que comprenden LPS fácilmente purificables. Estas técnicas conocidas normalmente implican la recogida de cultivos bacterianos en fase estacionaria temprana, de acuerdo con prácticas bacteriológicas convencionales. Sin embargo, se ha observado que el grado de acilación del LPS producido de acuerdo con condiciones conocidas es variable. Por ejemplo, el contenido de especies de heptaacilo en el lípido A de R595 de S. minnesota puede variar del 20 % al 80 %, dependiendo del lote (Rietschel y col., Rev. Infect. Dis. 9:S527 (1987)). Esta variabilidad en el contenido de congéneres de heptaacilo daría como resultado las diferencias significativas en el contenido de congéneres de hexaacilo en el 3D-MLA preparado a partir de estos lotes de LPS.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de extracción de lipopolisacárido (LPS) a partir de un cultivo de células de cepa bacteriana mutante rugosa profunda, que comprende:

a. extraer las células con una solución que consiste esencialmente en al menos el 75 % en peso de un alcohol alifático que tiene de 1 a 4 átomos de carbono y en el agua del resto; produciendo de este modo células con contenido fosfolipídico reducido;

b. extraer las células con contenido fosfolipídico reducido con una solución que comprende cloroformo y metanol, produciendo de este modo una solución de LPS en cloroformo y metanol, en la que la extracción con alcohol alifático se lleva a cabo a una temperatura entre 35 2C y 65 2C.

El procedimiento proporciona soluciones de LPS en CM que tienen contenido en fosfolípidos reducido y que por lo tanto son muy adecuados para modificación y peurificación adicionales de 3D-MLA. El procedimiento implica etapas relativamente simples y económicas.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la memoria descriptiva y están incluidos para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

La Figura 1 muestra placas de CCF de extractos de etanol y muestras de LPS obtenidas con diferentes temperaturas durante las extracciones con etanol. La placa de la izquierda muestra, de izquierda a derecha, los extractos de etanol a temperaturas de 22 2C, 37 2C y 50 2C. La muestra en el extremo derecho de esta placa es una muestra de LPS auténtica. La placa a la derecha muestra los LPS obtenidos de cada preparación. Las muestras en los carriles 3, 4 y 5 se corresponden con LPS de células sometidas a pre-extracciones con etanol a 22 2C, 37 2C y 50 2C, respectivamente. Las bandas pesadas a Rf~0,6 se corresponden con fosfolípido e impurezas de ácidos grasos. Los niveles de estas impurezas se reducen aumentando la temperatura de las extracciones con etanol y son muy bajos en la muestra que se pre-extrajo a 50 2C.

Descripción de realizaciones ilustrativas

Los lipopolisacáridos son el principal constituyente lipídico en la valva externa de la membrana externa de bacterias gram-negativas. La fracción de lipopolisacáridos de una bacteria gram-negativa comprende, entre otros componentes, lípido A. Como se ha descrito, el lípido A puede descarbohidratarse y desfosforilarse parcialmente para proporcionar monofosforil-lípido A (MLA) y MLA puede desacilarse selectivamente en la posición 3 para proporcionar 3-0-desacil-4'-

monofosforil-lípido A (3D-MLA).

Sin embargo, el lípido A producido por bacterias gram-negativas normalmente comprende varias especies que tienen la misma estructura de lípido A global pero difieren en el número de restos de ácidos grasos que contienen. Grupos de especies del lípido A con el mismo número de ácidos grasos se denominan en el presente documento "congéneres". Los congéneres del lípido A que tienen de 4 a 7 restos de ácidos grasos se producen por cultivo a escala comercial convencional de bacterias gram-negativas tales como R595 de S. minnesota. Como resultado, 3D-MLA producido de, por ejemplo, lípido... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de extraer lipopolisacárido (LPS) de un cultivo de células de cepa bacteriana mutante rugosa profunda, que comprende:

a. extraer las células con una solución que consiste esencialmente en al menos el 75 % en peso de un alcohol alifático 5 que tiene de 1 a 4 átomos de carbono y en el agua del resto; produciendo de este modo células con contenido

fosfolipídico reducido;

b. extraer las células con contenido fosfolipídico reducido con una solución que comprende cloroformo y metanol, produciendo de este modo una solución de LPS en cloroformo y metanol,

en el que la extracción con alcohol alifático se lleva a cabo a una temperatura entre 35 2C y 65 2C.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la cepa bacteriana mutante rugosa profunda es del género

Salmonella o Escherichia.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la cepa bacteriana mutante rugosa profunda del género Salmonella es de la especie Salmonella minnesota

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la cepa bacteriana mutante rugosa profunda de la especie 15 Salmonella minnesota es la cepa R595 de Salmonella minnesota

5. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la cepa bacteriana mutante rugosa profunda del género Escherichia es de la especie Escherichia coli.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la cepa bacteriana mutante rugosa profunda de la especie Escherichia colies de la cepa D31m4 de Escherichia coli.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el alcohol alifático tiene de 2 a 4 átomos de carbono.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el alcohol alifático es etanol.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la solución que comprende alcohol alifático comprende entre el 85 % en peso y el 95 % en peso de alcohol alifático.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la temperatura está entre 45 2C y 55 2C.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente evaporar el cloroformo y el metanol de la

solución de LPS, produciendo de esta forma un residuo de LPS seco.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente someter el residuo de LPS a hidrólisis ácida y a hidrólisis básica secuenciales, para formar 3D-MLA.