Cultivos de células madre.

Un compuesto que tiene la fórmula:**Fórmula**

donde,

L2 es alquileno C1-C6 sin sustituir;

e

y es un número entero de 0 a 3;

z es un número entero de 0 a 5;

X es -N≥, -CH≥ o -CR5≥;

R1 es hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilo sustituido o sin sustituir;

R3 es -OR18, y R18 es hidrógeno o alquilo C1-C10 sin sustituir;

R4 y R5 son independientemente -CN, -S(O)nR6, -NR7R8, -C(O)R9, -NR10-C(O)R11, -NR12-C(O)-OR13, - C(O)NR14R15, -NR16S(O)2R17, -OR18, -S(O)2NR19, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilo sustituido o sin sustituir, donde n es un número entero de 0 a 2; y

R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilo sustituido o sin sustituir;

o un racemato, diastereómero, tautómero, o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Cultivos de células madre

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad del documento de Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/2.88, presentado el 3 de diciembre de 28, que se incorpora en su totalidad en el presente documento para todos los

fines.

Antecedentes de la invención

Las células madre embrionarias (ESCs) son células pluripotentes que tienen la capacidad de autorrenovarse indefinidamente y de diferenciarse en todos los tipos de células del organismo (Thomson, J.A. et al., Science 282 (5391): 1145-1147 (1998); Thomson, J.A. y Odorico, J.S., Trends Biotechnol 18 (2): 53-57 (2)). Esta capacidad proporciona la esperanza de que las ESC se usen un día para reemplazar las células perdidas y dañadas, y proporcionen terapias fuera del alcance de los fármacos convencionales. Sin embargo, para llevar a cabo completamente los potenciales clínicos de las hESC, se tienen que establecer condiciones de cultivo definidas químicamente, libres de alimentadores y productos animales, y sólidas. Aunque se ha informado de varios medios definidos químicamente (Yao, S. et al., Proc Nati Acad Sci U S A 13 (18): 697-6912 (26); Lu, J. et al., Proc Nati Acad Sci U S A 13 (15): 5688-5693 (26); Ludwig, T.E. etal., Nat Biotechnol 24 (2): 185-187 (26)), aún son en gran medida insatisfactorios debido al rendimiento subóptimo de las células en los mismos. Especialmente en estas condiciones, cuando las células se pasan a células individuales por tripsinización, experimentan una considerable muerte celular. Se conocen diversas rutas de señalización que median la autorrenovación de las hESC, incluyendo FGF, TGF-p, Wnt, etc. (James, D. et al., Development 132 (6): 1273-1282 (25); Xu, R.H. et al., Nat Methods 2 (3): 185-19 (25); Beattie, G.M. et al., Stem Cells 23 (4): 489^95 (25); Greber, B., Lehrach, H., y Adjaye, J., Stem Cells 25 (2): 455-464 (27); Sato, N. et al., Nat Med 1 (1): 55-63 (24)). Sin embargo, ninguna de ellas parece actuar como factor de supervivencia en este proceso, siendo difícil de conseguir el mecanismo molecular de las mismas.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula:

donde, L2 es alquileno C1-C6 sin sustituir; y es un número entero de a 3; z es un número entero de a 5; X es -N=, -CH= o -CR5=; R1 es hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilo sustituido o sin sustituir; R3 es -OR18, y R18 es hidrógeno o alquilo C1-C1 sin sustituir;

R4 y R5 son independientemente CN, S()nR6, NR7R8, C()R9, NR1-C(O)R11, NR12-C()-R13, -C()NR14R15, - NR46S()2R17, -OR18, -S()2NR19, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilo sustituido o sin sustituir donde n es un número entero de a 2;

y R6, R7, R8, R9, R1, R , R12, R13, R14, R15, R16, R17y R19son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilo sustituido o sin sustituir; o un racemato, diastereómero, tautómero, o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones, L2 es metileno.

En algunas realizaciones, X es -N= o -CH=.

En algunas realizaciones, z es 1.

En algunas realizaciones, y es o 1.

En algunas realizaciones, L2 es metlleno; X es -N= o -CH=; R1 es hidrógeno; e y y z son. En algunas realizaciones, el compuesto tiene la fórmula:

o

La presente invención también proporciona un método para estabilizar una célula animal aislada in vitro, comprendiendo el método poner el contacto una célula animal con una cantidad suficiente de un compuesto de fórmula II para estabilizar la célula

En algunas realizaciones, el método comprende además cambiar las condiciones o el entorno de la célula en presencia del compuesto, donde la etapa de cambio en ausencia del compuesto podría dar como resultado un cambio en la programación celular de la célula. En algunas realizaciones, la etapa de cambio comprende al menos uno de descongelar las células y disociar las células de otras células.

En algunas realizaciones, la célula es adherente. En algunas realizaciones, la célula está en suspensión.

En algunas realizaciones, el método comprende además determinar un fenotipo de la célula.

En algunas realizaciones, el método comprende aislar las células de un animal. En algunas realizaciones, el animal es un ser humano. En algunas realizaciones, el animal es un animal no humano.

La presente invención también proporciona un método para mantener la supervivencia celular, comprendiendo el método generar células madre aisladas; e Inducir la estabilización de E-cadherlna en las células aisladas, poniendo en contacto las células madre aisladas con una cantidad de un compuesto de fórmula II suficiente para mejorar la supervivencia de las células madre aisladas al menos 2 veces cuando se compara con la ausencia del compuesto, manteniendo de ese modo la supervivencia celular.

La presente invención también proporciona una población de células aisladas que comprende una cantidad de un compuesto de fórmula II suficiente para mejorar la supervivencia de las células aisladas al menos 2 veces cuando se compara con la ausencia de la molécula.

En algunas realizaciones, las células se seleccionan entre el grupo que consiste en células madre, células madre inducidas, células madre pluripotentes, células precursoras, células diferenciadas, células beta y fibroblastos.

DEFINICIONES

Las abreviaturas que se usan en el presente documento tienen su significado convencional dentro de las técnicas químicas y biológicas.

La expresión "estabilizar la célula" se refiere a reducir básicamente o eliminar la respuesta de una célula a un cambio en las condiciones o el entorno al que está expuesta la célula. En este contexto, "reducir básicamente" significa que la respuesta es al menos un 5 % menor que la que se produciría en ausencia de un componente estabilizante (por ejemplo, los compuestos de la Invención).

La expresión "cambiar las condiciones o el entorno de una célula" se refiere a cambiar la temperatura, los medios de cultivo (por ejemplo, fuente de carbono, concentración salina, factor de crecimiento), disociar las células en células aisladas, descongelar las células, o cambiar de otro modo un factor de un entorno inmediato de la célula. Tal como se analiza en el presente documento, cambiar las condiciones o el entorno de una célula a menudo cambia el fenotipo de la célula o la programación celular. Por ejemplo, las células madre, así como otras células, cuando se aíslan se diferenciarán y/o morirán en respuesta a ciertos cambios tales como aislamiento, descongelación, etc. Por lo tanto, cambiar las condiciones puede reducir o eliminar la viabilidad celular mientras que las células estabilizadas como se describen en el presente documento no ven básicamente reducida la viabilidad con los mismos cambios de condiciones. El cambio en la programación de la célula también se puede monitorizar como la respuesta de la célula a un estímulo específico y es característico para un cierto tipo de célula y/o como la expresión de uno o un conjunto de genes característicos o productos génicos. A modo de ejemplo no limitante, se conoce que las células madre pluripotentes humanas expresan al menos alguno, y opcionalmente todos, los marcadores de la siguiente lista: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-6, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-cadherina, UTF-1, Oct4, Rex1, y Nanog. Tal expresión puede cambiar a medida que una célula madre pierde pluripotencla o se diferencia de otro modo. Una célula madre pluripotente humana estabilizada debería mantener su patrón de expresión característico después de un cambio de condiciones.

Una célula "aislada" ha sido separada básicamente o purificada de otras células de un organismo.

El término "disociar" células se refiere a un proceso de aislamiento de células de otras células o de una superficie (por ejemplo, la superficie de una placa de cultivo). Por ejemplo, las células se pueden disociar de un animal o tejido mediante métodos mecánicos o enzlmátlcos. Alternativamente, las células que se agregan in vitro se pueden disociar... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto que tiene la fórmula:

O

donde,

L2 es alquileno Ci-C6S¡n sustituir; e y es un número entero de a 3; z es un número entero de a 5;

X es -N=, -CH= o -CRS=;

R1 es hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilo sustituido o sin sustituir;

R3 es -OR18, y R18 es hidrógeno o alquilo C1-C1 sin sustituir;

R4 y R5 son independientemente -CN, -S()nR6, -NR7R8, -C()R9, -NR1-C(O)R11, -NR12-C()-R13, - C()NR14R15, -NR1sS()2R17, -OR18, -S()2NR , alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilo sustituido o sin sustituir, donde n es un número entero de a 2; y

R6, R7, R8, R9, R1, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o heteroarilo sustituido o sin sustituir;

o un racemato, diastereómero, tautómero, o un isómero geométrico del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El compuesto de la reivindicación 1, donde L2 es metileno.

3. El compuesto de la reivindicación 1, donde X es -N= o -CH=.

4. El compuesto de la reivindicación 1, donde R1 es hidrógeno.

5. El compuesto de la reivindicación 1, donde L2 es metileno;

X es -N= o -CH=;

R1 es hidrógeno; e y y z son.

6. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene la fórmula:

O

O

N

o

7. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene la fórmula:

o

N s

OCH3

8. El compuesto de la reivindicación 1 que tiene la fórmula:

O

9. Un método para estabilizar una célula animal aislada in vitro, comprendiendo el método poner en contacto una célula animal con una cantidad suficiente de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1- 8 para estabilizar la célula.

1. Un método para mantener la supervivencia celular, comprendiendo el método, generar células madre aisladas; e

inducir la estabilización de E-cadherina en las células aisladas al poner en contacto las células madre aisladas con una cantidad de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 suficiente para mejorar la 15 supervivencia de las células madre aisladas al menos 2 veces en comparación con la ausencia del compuesto, manteniendo de ese modo la supervivencia celular.

11. Una población de células aisladas que comprende una cantidad de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 suficiente para mejorar la supervivencia de células aisladas en al menos 2 veces en

comparación con la ausencia del compuesto, y opcionalmente donde las células se seleccionan entre el grupo que consiste en células madre, células madre inducidas, células madre pluripotentes, células precursoras, células diferenciadas, células beta y fibroblastos.