Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta.

Un vector de expresión que codifica una proteína de fusión de albúmina IFN-beta,

en donde la proteína de fusión tiene la proteína IFN-beta de longitud completa que incluye la secuencia líder de IFN-beta nativa fusionada al extremo amino de la forma madura de la seroalbúmina humana, y en donde el vector de expresión es el vector de expresión NSO pEE12.

Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta.

Antecedentes de la invención La invención se refiere en general a proteínas terapéuticas (incluyendo, entre otros, al menos un polipéptido, anticuerpo, péptido o fragmento y variante del mismo) condensadas a albúmina o fragmentos o variantes de la 5 albúmina. La invención abarca polinucleótidos que codifican proteínas terapéuticas de fusión de albúmina, proteínas terapéuticas de fusión de albúmina, composición, composiciones farmacéuticas y kits. Las células huésped transformadas con los polinucleótidos que codifican proteínas terapéuticas de fusión de albúmina también entran dentro de la invención, así como los procedimientos para fabricar las proteínas de fusión de albúmina de la invención usando estos polinucleótidos y/o células huésped. 10

La seroalbúmina humana (HSA o HA) , una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura (como se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº 1038) ) , es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica de suero y también funciona como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. En la actualidad, la HA para uso clínico se produce mediante extracción de sangre humana. La producción de HA recombinante (rHA) en microorganismos se ha divulgado en los documentos EP 330 451 y EP 361 991. 15

Las proteínas terapéuticas en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante, tales como interferones y hormonas de crecimiento, normalmente son moléculas lábiles que exhiben semividas cortas, en particular cuando se formulan en soluciones acuosas. La inestabilidad en estas moléculas cuando se formulan para administración dicta que muchas de las moléculas se deben liofilizar y refrigerar en todo momento durante el almacenamiento, de modo que hace que las moléculas sean difíciles de transportar y/o almacenar. Los problemas 20 de almacenamiento son particularmente agudos cuando las formulaciones farmacéuticas se deben almacenar y dispensar fuera del entorno hospitalario.

Se han propuesto pocas soluciones prácticas a los problemas de almacenamiento de las moléculas proteicas lábiles. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de formulaciones de larga duración estabilizadas de moléculas terapéuticas proteináceas que se dispensan fácilmente, preferentemente con una sencilla formulación que requiere 25 una mínima manipulación posterior a la conservación.

Sumario de la invención La expresión “una proteína terapéutica” usado en esta memoria descriptiva hace referencia a la forma madura de interferón-beta (IFN-beta/IFN-β) .

La presente invención proporciona un vector de expresión que codifica la secuencia líder del IFN-beta nativo 30 condensada con una proteína de fusión de la albúmina IFN-beta que tiene la forma madura de la proteína IFN-beta condensada con el extremo amino de la forma madura de la HSA, en el que el vector de expresión es el vector de expresión de NS0 pEE12, 1. En una realización, el vector de expresión codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 772 de la SEC ID Nº . 322. La presente invención también proporciona una célula huésped de mamífero que comprende el vector de expresión de la invención. La presente invención también proporciona un 35 procedimiento de producción de una proteína de fusión de la albúmina que comprende cultiva una célula huésped de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión de la albúmina y aislar la proteína de fusión de la albúmina.

La presente invención también proporciona una proteína de fusión albúmina - interferón beta madura codificada por el vector de expresión de la reivindicación 1. La presente invención también proporciona proteínas de fusión 40 albúmina – interferón-beta para su uso en medicina, por ejemplo para usar en el tratamiento de esclerosis múltiple; cáncer, tal como melanoma, cáncer renal, cáncer pulmonar, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, un sarcoma, un linfoma, cáncer de cerebro, glioma, displasia cervical, leucemia, preleucemia, mieloma múltiple; trastornos de la médula ósea; trastornos óseos; neoplasias malignas y trastornos hematológicos; infecciones bacterianas; trombocitopenia; infecciones virales, tales como 45 infecciones por VIH, infecciones por hepatitis, infecciones por papilomavirus humano, infecciones por el virus del herpes simple; fibrosis pulmonar; degeneración macular; enfermedad de Crohn; trastornos neurológicos; artritis; colitis ulcerosa; osteoporosis: osteopenia, fibromialgia; síndrome de Sjögren; síndrome de fatiga crónica; fiebres, tales como fiebres hemorrágicas virales; diabetes, tales como diabetes insipidus y diabetes mellitus; hiperglucemia; resistencia a la insulina, deficiencia de insulina, hiperlipidemia; hipercetonemia; afecciones asociadas con la 50 diabetes, incluyendo, entre otros, obesidad, cardiopatía, hiperglucemia, infecciones retinopatía y/o úlceras; trastornos metabólicos, trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X.

En el presente documento también se divulgan formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de la albúmina de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas formulaciones pueden 55 estar en un kit o recipiente. Dicho kit o recipiente puede estar envasado con instrucciones pertenecientes a la semivida prolongada de la proteína terapéutica. Dichas formulaciones se pueden usar en procedimientos de tratamiento, prevención, mejora o diagnóstico de una enfermedad o síntomas de enfermedades en un paciente, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, que comprende la etapa de administrar la formulación farmacéutica al paciente.

En el presente documento también se divulgan procedimientos de prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad o trastorno. En realizaciones preferidas, la presente invención abarca proteínas de fusión de la albúmina 5 para usar en el tratamiento de una enfermedad o trastorno enumerado en la columna “Indicación Preferida: Y”, de la Tabla 1 que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora una proteína de fusión de la albúmina de la invención que comprende una proteína terapéutica o una porción correspondiente a una proteína terapéutica (o fragmento o variante de la misma) divulgada en a columna de “Proteína terapéutica: X" de la Tabla 1 (en la misma fila que la enfermedad o trastorno que se va a tratar se indica en 10 la columna "Indicación preferida: Y" de la Tabla 1) en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.

La proteína de fusión de la albúmina descrita en la Tabla 1 o 2 tiene una semivida ampliada.

La proteína de fusión de la albúmina descrita en la Tabla 1 o 2 es más estable que la correspondiente molécula terapéutica sin condensar descrita en la Tabla 1. 15

En el presente documento también se divulgan organismos transgénicos modificados para que contengan moléculas de ácido nucleico de la invención (los polinucleótidos descritos en las Tablas 1 y 2) , preferentemente, modificados para que expresen una proteína de fusión de la albúmina de la invención.

Breve descripción de las figuras La Figura 1A-D muestra la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la albúmina humana (SEC ID Nº 20 1038) y un polinucleótido que la codifica (SEC ID Nº 1037) .

La Figura 2 muestra el efecto de varias diluciones de las proteínas de fusión de albúmina e IFNb codificadas por el ADN comprendido en las CID 2011 y 2053, sobre la actividad SEAP en las células indicadoras ISRE-SEAP/293F (véase el Ejemplo 4) . Las proteínas se diluyeron en serie de 5e-7 a le-14 g/ml en DMEM/10 % de FBS y se usan para tratar las células indicadoras ISRE-SEAP/293F. Tras 24 horas se extrajeron los 25 sobrenadantes de las células indicadoras y se analizó su actividad SEAP. La proteína de fusión de albúmina e IFNb se purificó a partir de tres clones estables. 293F/#2011, CHO/#2011 y NSO/#2053. IFNb derivado de mamífero, Avonex, procedían de Biogen y se comunicó que tenían una actividad específica de 2, 0 e5 UI/ug.

Descripción detallada

Definiciones 30

Las definiciones siguientes se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados en esta memoria.

Como se usa en el presente documento, “polinucleótido” hace referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión que codifica una proteína de fusión de albúmina IFN-beta, en donde la proteína de fusión tiene la proteína IFN-beta de longitud completa que incluye la secuencia líder de IFN-beta nativa fusionada al extremo amino de la forma madura de la seroalbúmina humana, y en donde el vector de expresión es el vector de expresión NSO pEE12. 5

2. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido codificado por el vector de expresión comprende los aminoácidos 1 a 772 de la SEC ID Nº 322.

3. Una célula huésped de mamífero que comprende un vector de expresión de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.

4. Un procedimiento para producir una proteína de fusión de albúmina, que comprende: 10

(a) cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 3 en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión de la albúmina; y

(b) aislar la proteína de fusión de la albúmina.

5. La proteína de fusión de albúmina-interferón beta madura definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. La proteína de fusión de albúmina-interferón de la reivindicación 5 para uso en medicina, por ejemplo para uso en 15 el tratamiento de la esclerosis múltiple; cáncer, tal como melanoma, cáncer renal, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, un sarcoma, un linfoma, cáncer de cerebro, glioma, displasia cervical, leucemia, preleucemia, mieloma múltiple; trastornos de la médula ósea; trastornos de los huesos; tumores malignos y trastornos hematológicos; infecciones bacterianas; trombocitopenia; infecciones virales, tales como infecciones por el VIH, infecciones por hepatitis, infecciones por 20 papilomavirus humano, infecciones por el virus del herpes simple; fibrosis pulmonar; degeneración macular; enfermedad de Crohn; trastornos neurológicos; artritis; colitis ulcerosa; osteoporosis; osteopenia; fibromialgia; síndrome de Sjögren; síndrome de fatiga crónica; fiebres, como las fiebres hemorrágicas virales; diabetes, tales como diabetes insípida y diabetes mellitus; hiperglucemia; resistencia a la insulina, deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; afecciones relacionadas con la diabetes, incluyendo, entre otras, obesidad, 25 cardiopatías, hiperglucemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión de peso corporal; supresión del apetito; Síndrome X.