Procedimientos para obtener una toxina clostrídica.

Método para obtener una toxina botulínica biológicamente activa,

que comprende las etapas de:

(a) obtener un medio de cultivo que está sustancialmente libre de productos derivados de animales y comprende el 4-8% en peso de un derivado de soja, y cultivar una bacteria Clostridium botulinum en el medio de cultivo;

(b) proporcionar un medio de fermentación que está sustancialmente libre de productos derivados de animales y comprende:

(i) el 4-8% en peso de un derivado de soja,

(ii) el 0-3% en peso de un extracto de levadura, y

(iii) el 1-2% en peso de glucosa;

(c) fermentar la bacteria Clostridium botulinum en el medio de fermentación en condiciones que permiten la producción de una toxina botulínica, incluyendo:

(i) llevar a cabo la etapa de fermentación a un pH de entre 5,0 y 5,5 tras el crecimiento celular inicial,

(ii) llevar a cabo la etapa de fermentación durante entre 45 horas y 75 horas,

(iii) llevar a cabo la etapa de fermentación a una temperatura de entre 33ºC y 36ºC, y

(iv) llevar a cabo la etapa de fermentación en una atmósfera anaerobia; y

(d) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación, en el que la etapa de recuperación es un procedimiento de purificación libre de productos animales.

Procedimientos para obtener una toxina clostrídica Antecedentes

La presente invención se refiere a un procedimiento para obtener toxina botulínica biológicamente activa. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento de cultivo sustancialmente libre de producto animal y fermentación anaerobia usando la bacteria Clostridium botulinum, para obtener toxina botulínica biológicamente activa abundante.

Una composición farmacéutica adecuada para la administración a un ser humano o animal para un propósito terapéutico, de diagnóstico, de investigación o cosmético puede comprender un principio activo. La composición farmacéutica también puede incluir uno o más excipientes, tampones, portadores, estabilizadores, conservantes y/o agentes de carga. El principio activo en una composición farmacéutica puede ser un producto biológico tal como una toxina botulínica. El principio activo de toxina botulínica usado para preparar una composición farmacéutica de toxina botulínica puede obtenerse mediante un procedimiento en múltiples etapas de cultivo, fermentación y elaboración que usa uno o más productos derivados de animales (tales como caldo de carne y componentes de caseína en uno o más de los medios de cultivo y fermentación usados para obtener una toxina botulínica a granel, y una fracción de sangre o excipiente hemoderivado en la composición farmacéutica de toxina botulínica elaborada final). La administración a un paciente de una composición farmacéutica en la que se obtiene el principio activo biológico mediante un procedimiento que usa productos derivados de animales puede someter al paciente a un posible riesgo de recibir diversos patógenos o agentes infecciosos. Por ejemplo, pueden estar presentes priones en una composición farmacéutica. Un prión es una partícula infecciosa proteica que se supone que surge como isoforma conformacional anómala a partir de la misma secuencia de ácido nucleico que constituye la proteína normal. Se ha planteado además la hipótesis de que la infectividad reside en una "reacción de inclusión" de la proteína de isoforma normal en la isoforma de proteína de prión a un nivel postraduccional. Aparentemente se Induce el plegamiento erróneo de la proteína celular endógena normal para obtener una conformación de prión patógena.

La enfermedad de Creutzfeldt-Jacob es un trastorno neurodegenerativo poco frecuente de encefalopatía espongiforme transmisible humana en el que el agente transmisible es aparentemente una Isoforma anómala de una proteína de prión. Un individuo con enfermedad de Creutzfeldt-Jacob puede deteriorarse desde una salud aparentemente perfecta hasta mutismo aclnétlco en el plazo de seis meses. Por tanto, puede existir un posible riesgo de adquirir una enfermedad mediada por priones, tal como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, por la administración de una composición farmacéutica que contiene un producto biológico, tal como una toxina botulínica, obtenido o elaborado usando productos derivados de animales.

Toxina botulínica

El género Clostridium tiene más de ciento veintisiete especies, agrupadas por morfología y función. La bacteria Gram positiva, anaerobia, Clostridium botulinum, produce una potente neurotoxina polipeptídica, la toxina botulínica, que provoca una enfermedad neuroparalítica en seres humanos y animales conocida como botulismo. Clostridium botulinum y sus esporas se encuentran comúnmente en el suelo y la bacteria puede crecer en recipientes de alimentos esterilizados y sellados de manera inapropiada de conservas caseras, que son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo aparecen normalmente de 18 a 36 horas tras comer los productos alimenticios infectados por un cultivo o esporas de Clostridium botulinum. Aparentemente, la toxina botulínica puede pasar de forma no atenuada a través del revestimiento del Intestino y atacar las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de intoxicación por toxina botulínica pueden avanzar desde dificultad para caminar, tragar y hablar hasta parálisis de los músculos respiratorios y muerte.

La toxina botulínica tipo A es el agente biológico natural más letal conocido por el ser humano. Aproximadamente 5 picogramos de toxina botulínica (complejo de neurotoxina purificado) tipo A es una DL5o en ratones. En base molar, la toxina botulínica tipo A es 1,8 billones de veces más letal que la difteria, 6 millones de veces más letal que el cianuro de sodio, 3 millones de veces más letal que la cobratoxina y 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxlns, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por B.R. Singh et al., Plenum Press, Nueva York (1976) (en el que la DL5o mencionada de toxina botulínica tipo A de ,3 ng igual a 1 U se corrige por el hecho de que aproximadamente ,5 ng de BOTOX® es igual a 1 unidad). BOTOX® es la marca comercial de un complejo de neurotoxina purificado de toxina botulínica tipo A disponible comercialmente de Allergan, Inc., de Irvine, California. Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la DL5o tras inyección intraperitoneal en ratones Swiss Webster hembra que pesan aproximadamente 18-2 gramos cada uno. En otras palabras, una unidad de toxina botulínica es la cantidad de toxina botulínica que mata al 5% de un grupo de ratones Swiss Webster hembra. Se han caracterizado siete neurotoxinas botulínicas generalmente distintas desde el punto de vista inmunológico, siendo estas respectivamente los serotipos A, B, C-i, D, E, F y G de neurotoxina botulínica, distinguiéndose cada uno de ellos mediante neutralización con anticuerpos específicos del tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en cuanto a la especie animal a la que afectan y en cuanto a la gravedad y la duración de la parálisis que provocan. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica tipo

A es 5 veces más potente, medido por la tasa de parálisis producida en la rata, que la toxina botulínica tipo B. Adicionalmente, se ha determinado que la toxina botulínica tipo B no es tóxica en primates a una dosis de 48 U/kg, que es aproximadamente 12 veces la DL5 en primates para la toxina botulínica tipo A. Las toxinas botulínicas se unen aparentemente con alta afinidad a neuronas motoras colinérgicas, se translocan al interior de la neurona y bloquean la liberación presináptica de acetilcolina.

Se han usado toxinas botulínicas en entornos clínicos para el tratamiento de, por ejemplo, trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. Se ha aprobado la toxina botulínica tipo A por la Food and Drug Administration estadounidense para el tratamiento de blefaroespasmo esencial, estrabismo y espasmos hemifaciales en pacientes de más de doce años de edad, para el tratamiento de distonía cervical y para el tratamiento de arrugas de líneas glabelares (faciales). La FDA también ha aprobado una toxina botulínica tipo B para el tratamiento de distonía cervical. Habitualmente se observan efectos clínicos de la inyección periférica (es decir intramuscular o subcutánea) de toxina botulínica tipo A en el plazo de una semana desde la inyección, y con frecuencia en el plazo de algunas horas tras la inyección. La duración típica de alivio sintomático (es decir parálisis muscular flácida) de una única inyección intramuscular de toxina botulínica tipo A puede ser de aproximadamente tres meses a aproximadamente seis meses.

Aunque todos los serotipos de toxinas botulínicas inhiben aparentemente la liberación del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, lo hacen afectando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o escindiendo estas proteínas en diferentes sitios. La toxina botulínica A es una cinc endopeptidasa que puede hidrolizar específicamente un enlace peptídico de la proteína intracelular asociada a vesículas, SNAP-25. La toxina botulínica tipo E también escinde la proteína asociada a sinaptosomas de 25 kiloDalton (kD) (SNAP-25), pero selecciona como diana secuencias de aminoácidos diferentes dentro de esta proteína, en comparación con la toxina botulínica tipo A. Las toxinas botulínicas tipo B, D, F y G actúan sobre la proteína asociada a vesículas (VAMP, también denominada sinaptobrevina), escindiendo cada serotipo a la proteína en un sitio diferente. Finalmente, se ha mostrado que la toxina botulínica tipo C1 escinde tanto la sintaxina como SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar a la potencia relativa y/o duración de acción de los diversos serotipos de toxina botulínica.

Independientemente del serotipo, el mecanismo molecular de intoxicación por toxina parece ser similar e implicar al menos tres etapas o fases. En... [Seguir leyendo]

Método para obtener una toxina botulínica biológicamente activa, que comprende las etapas de:

(a) obtener un medio de cultivo que está sustancialmente libre de productos derivados de animales y comprende el 4-8% en peso de un derivado de soja, y cultivar una bacteria Clostrídium botulinum en el medio de cultivo;

(b) proporcionar un medio de fermentación que está sustancialmente libre de productos derivados de animales y comprende:

(i) el 4-8% en peso de un derivado de soja,

(ii) el -3% en peso de un extracto de levadura, y

(iii) el 1-2% en peso de glucosa;

(c) fermentar la bacteria Clostrídium botulinum en el medio de fermentación en condiciones que permiten la producción de una toxina botulínica, incluyendo:

(i) llevar a cabo la etapa de fermentación a un pH de entre 5, y 5,5 tras el crecimiento celular inicial,

(ii) llevar a cabo la etapa de fermentación durante entre 45 horas y 75 horas,

(iii) llevar a cabo la etapa de fermentación a una temperatura de entre 33°C y 36°C, y

(iv) llevar a cabo la etapa de fermentación en una atmósfera anaerobia; y

(d) recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación, en el que la etapa de recuperación es un procedimiento de purificación libre de productos animales.