Procedimiento para la selección de linfocitos T antígeno-específicos mediante la identificación de dobletes.

Procedimiento lo selección de linfocitos T antígeno-específicos mediante la identificación de dobletes.

La presente invención se refiere al campo médico, particularmente a un procedimiento para la selección de linfocitos T antígeno-específicos para su uso en terapia. Adicionalmente, la presente invención también se refiere a un procedimiento para la selección de linfocitos T antígeno-específicos alodepleccionados para su uso en terapia.

Campo de la técnica La presente invención se refiere al campo médico, particularmente a un procedimiento para la selección de linfocitos T antígeno-específicos para uso en terapia, más concretamente para su uso en trasplantes.

Antecedentes de la invención Los trabajos de investigación llevados a cabo por los autores de la presente invención han permitido desarrollar un nuevo procedimiento de profilaxis de la enfermedad injerto contra huésped (EICH) basado en la utilización de inhibidores de proteosomas, como el bortezomib (W02007/090912) . Estos fármacos actúan bloqueando la degradación de I-kB lo que, finalmente, impide la transcripción al núcleo de NF-kB, factor de transcripción clave en la activación linfocitaria. Mediante este procedimiento se ha demostrado que puede generarse, tras cultivo in vitro de linfocitos del donante y células mononuclcadas del receptor, una apoptosis y depleción selectiva de linfocitos T (LT) alorreactivos, responsables de la enfermedad injerto contra huésped, manteniendo la viabilidad de poblaciones de L T con actividad reguladora / supresora. De esta forma, la depleción de LT aloreactivos empleando bortezomib in vitro permite eliminar específicamente aquellos linfocitos que se activan en el cultivo mixto preservando el resto de poblaciones linfocitarias. En este sentido, en ausencia de péptido pp65 de CMV en el cultivo mixto se ha comprobado cómo, en un cultivo secundario, los LT alodepleccionados mantienen la reactividad frente a CMV mientras que se pierde la reactividad frente a las células estimuladoras presentes en un cultivo primario y al contrario, cómo la presencia de pp65 /CMV en el cultivo primario elimina la respuesta anti-CMV en el cultivo secundario. Estos hallazgos han sido la base para el desarrollo de diversos ensayos clínicos en los que se ha confirmado cómo el uso de bortezomib peritrasplante disminuye el riesgo de EICH incluso en pacientes sometidos a trasplante de donante no emparentado.

Sin embargo, precisamente en el efecto CltOtóx1cO de los linfocitos T (LT) del donante sobre órganos vitales del paciente causado por la enfermedad injerto contra huésped, reside también el efecto curativo del trasplante alogénico, ya que los linfocitos del donante desencadenan una respuesta inmune frente al tejido hematopoyético y las células tumorales del paciente, provocando el efecto injerto contra leucemia (EICL) . De hecho en la actualidad aún no se ha podido desarrollar ningún procedimiento que permita separar el EICL de la EICH de manera que, en la práctica, los procedimientos más eficaces en la prevención de la EICH, como la depleción de LT del donante, provocan también una inmunosupresión más profunda y, por tanto, un mayor riesgo de recaída (menor EICL) o de infecciones potencialmente fatales en el periodo postrasplante.

Por lo tanto, la presente invenClOn se enfrenta, entre otros, al problema de eliminar los linfocitos aloreactivos manteniendo una respuesta citotóxica adecuada frente a las células tumorales.

Breve descripción de la invención Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento (de aquí en adelante "procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos alodepleccionados de la invención") para la selección de linfocitos T antígeno-específicos alodcpleccionados que comprende las siguientes etápas:

a. generar un cultivo mixto in vltro que comprenda linfocitos T (células efectoras) del donante y células del receptor, exponiendo dicho cultivo a un inhibidor del NF-kB para generar la alodeplección selectiva de los linfocitos T alorreactivos;

b. generar un segundo cultivo mixto in vitro que comprenda los linfocitos T (células efectoras) una vez han sido alodepleccionados del paso a) y células que presenten al menos un antígeno de interés (células diana) del receptor;

c. seleccionar células que estén formando uniones estables (dobletes) , identificándose éstas por su positividad para un antígeno T específico y para un marcador específico o no de las células diana;

d. separar las células efectoras de las células diana que forman los dobletes seleccionados en el paso c) ; y

e. opcionalmente aislar las células efectoras de las células diana.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, las células diana de] paso a) del procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos alodepleccionados de la invención, se seleccionan de la lista que consiste en células mononucleadas o células dendríticas. Adicionalmente, las células diana del receptor del paso b) del procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos alodepleccionados de la invención, se seleccionan de la lista que consiste en células mononucleadas, células tumorales y células dendríticas.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención el cultivo mixto del paso b) del procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos alodepleccionados de la invención, se mantiene por un período entre 3 y 24 horas, preferentemente entre 10 Y 17, 5 horas, más preferentemente el cultivo mixto se mantiene por un periodo de 15 horas.

En aún otra realización preferida del primer aspecto de la invención, la selección de los dobletes del paso c) del procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos alodepleccionados de la invención se realiza por citometría de flujo o "cell sorting". Preferentemente los dobletes se identifican por su positividad para el antígeno de superficie T específico CD3 y para el marcador de las células diana PKH-67.

En otra realización preferida de la invención, la separación de las células efectoras de las células diana del paso d) del procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos de la invención se realiza incubando los dobletes del paso b) en placas de cultivo en presencia de medio RPMI con 10% de SAB durante un periodo de 10 a 15 horas.

En aún otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el inhibidor del NF-kB del paso a) del procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos alodepleccionados de la invención es bortezomib.

Adicionalmente, se hace notar que la alodeplección del producto, paso a) , se puede realizar previa o posteriormente a la selección de los linfocitos T antígeno-específicos. Preferentemente dicha alodeplección se realiza previamente a la selección de los linfocitos.

Se hace notar que cualquiera de las realizaciones preferidas del primer aspecto de la invención pueden combinarse entre sÃ?.

Por otro lado, un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento (de aquí en adelante "procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos de la invención") para la selección de linfocitos T antígeno-específicos que comprende las siguientes étapas:

a. generar un cultivo mixto in vitro que comprenda linfocitos T (células efectoras) y células que presenten al menos un antígeno de interés (células diana) ;

b. seleccionar células que estén formando uniones estables (dobletes) , identificándose éstas por su positividad para un antígeno T específico y para un marcador específico o no de las células diana;

c. separar las células efectoras de las células diana que forman los dobletes seleccionados en el paso b) ; y

d. opcionalmente aislar la células efectoras de las células diana.

En una realización preferida del segundo aspecto de la invención el cultivo mixto del paso a) se mantiene por un periodo cntre 3 y 24 horas, preferentemente entre 10 y 17, 5 horas, más preferentemente el cultivo mixto se mantiene por un período de 15 horas.

En otra realización preferida del segundo aspecto ele la invención, la selección de los dobletes del paso b) del procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos de la invención se realiza por citometría de flujo o "ccll sorting". Preferentemente los dobletes se identifican por su positividad para el antígeno de superficie T específico CD3 y para el marcador de las células diana PKH-67. No obstante, cualquier otro marcador específico de la célula diana normal, presentadora de antígenos -por ejemplo derivados de patógenos-o tumoral serviría para poner en práctica la presente invención.

En aún otra realización preferida de la invención, la separación de las células efectoras de las células diana del paso c) del procedimiento de selección de linfocitos T antígeno-específicos de la invención se realiza incubando los dobletes del paso b) en placas de cultivo... [Seguir leyendo]

l. Procedimiento para la selección de linfocitos T antígeno-específicos que comprende las siguientes etapas:

a. generar un cultivo mixto in vitro que comprenda linfocitos T (células efectoras) y células que presenten al menos un antígeno de interés (células diana) ;

b. seleccionar células que estén formando uniones estables (dobletes) , identificándose éstas por su positividad para un antígeno T específico y para un marcador específico o no de las células diana; y

c. separar las células efectoras de las células diana que forman los dobletes seleccionados en el paso b) ; y

d. opcionalmente aislar las células efectoras de las células diana.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, dónde las células diana se seleccionan de la lista que consiste en células dendríticas, células mononuc1eares, células tumorales o bacterianas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, donde el cultivo mixto del paso a) comprende linfocitos T (células efectoras) y células que presenten al menos un antígeno de interés (células diana) de distintos individuos (células alogénicas) y se mantiene por un período entre 3 Y 24 horas.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, donde el cultivo mixto del paso a) comprende linfocitos T (células efectoras) y células que presenten al menos un antígeno de interés (células diana) de distintos individuos (células alogénicas) y se mantiene por un período entre 10 Y 17, 5 horas.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, donde el cultivo mixto del paso a) comprende linfocitos T (células efectoras) y células que presenten al menos un antígeno de interés (células diana) de distintos individuos (células alogénicas) y se mantiene por un período de 15 horas.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la selección de los dobletes del paso b) se realiza por citometría de fluj o.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde los dobletes se identifican por su positividad para el antígeno de superficie T específico CD3 y para el marcador de las células diana PKH-67.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, dónde la separación de las células efectoras de las células diana del paso c) se realiza incubando los dobletes del paso b) en placas de cultivo en presencia de medio RPMI con 10% de SAB durante un período de 10 a 15 horas.

9. Procedimiento para la selección de linfocitos T antígeno-específicos alodepleccionados que comprende las siguientes etapas:

a. generar un cultivo mixto in vitro que comprenda linfocitos T (células efectoras) del donante y células del receptor, exponiendo dicho cultivo a un inhibidor del NF-kB para generar la alodeplección selectiva de los linfocitos T alorreactivos;

b. generar un segundo cultivo mixto in vitro que comprenda los linfocitos T (células efectoras) una vez han sido alodepleccionados del paso a) y células que presenten al menos un antígeno de interés (células diana) del receptor;

c. seleccionar células que estén formando uniones estables (dobletes) , identificándose éstas por su positividad para un antígeno T específico y para un marcador específico o no de las células diana; y

d. separar las células efectoras de las células diana que forman los dobletes seleccionados en el paso c) ; y

e. opcionalmente aislar la células efectoras de las células diana.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, dónde las células diana del receptor se seleccionan de la lista que consiste en células mononuc1eadas ó células dendríticas.

11. Procedimiento según la reivindicación 9 o 10, donde las células diana del receptor se seleccionan de la lista que consiste en células mononuc1eadas, células tumorales y células dendríticas.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el cultivo mixto del paso a) comprende linfocitos T (células efectoras) y células que presenten al menos un antígeno de interés (células diana) de distintos individuos (células alogénicas) y se mantiene por un período entre 3 y 24 horas.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el cultivo mixto del paso a) es un co-cultivo entre células alogénicas que se mantiene por un período entre 10 y 17, 5 horas.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el cultivo mixto del paso a) es un co-cultivo entre células alogénicas que se mantiene por un período de 15 horas.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde la selección de los dobletes del paso b) se realiza por citometria de fluj o.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, donde los dobletes se identifican por su positividad para el antígeno de superficie T específico CD3 y para el marcador de las células diana PKH-67.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, donde la separación de las células efectoras de las células diana del paso c) se realiza incubando los dobletes del paso b) en placas de cultivo en presencia de medio RPMI con 10% de SAB durante un período de 10 a 15 horas.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, dónde el inhibidor del NFkB es bortezomib.

19. Linfocitos T obtenibles de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

20. Uso de los linfocitos T obtenibles de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18 para la elaboración de un medicamento para su uso en trasplantes.

21. Uso de los linfocitos T de acuerdo con la reivindicación 20, donde el trasplante es el trasplante hematopoyético.

22. Composición que comprende los linfocitos T obtenibles de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

23. La composición de la reivindicación 22, donde dicha composición es una composición

farmacéutica que opcionalmente comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.