Regiones de escisión KEX2 de proteínas de fusión recombinantes.

Un constructo de ADN de fusión que codifica un polipéptido de fusión que comprende en unión operable desde el extremo 5' de dicho constructo,

un promotor;

una primera molécula de ADN que codifica una secuencia señal funcional como una secuencia secretora en una célula fúngica filamentosa;

una segunda molécula de ADN que codifica una proteína portadora, donde la proteína portadora es un polipéptido fúngico secretado de manera natural o una porción funcional del mismo;

una tercera molécula de ADN que codifica una región KEX2, donde la región KEX2 es LAVEKR; y una cuarta molécula de ADN que codifica una proteína deseada.

Regiones de escisión KEX2 de proteínas de fusión recombinantes

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a una secreción y escisión aumentada de proteínas deseadas,

como proteínas de anticuerpos funcionales y enzimas industriales a partir de hongos filamentosos. La invención revela constructos de ADN de fusión, vectores y polipéptidos de fusión que incorporan regiones KEX2 para la escisión de proteínas y métodos de producción de las proteínas deseadas.

ANTECENDENTES

Durante la secreción de proteínas en una célula fúngica, determinadas proteínas se escinden mediante KEX2, un miembro de la familia KEX2 o familia "kexina" de serina peptidasa (EC 3.4.21.61) . KEX2 es una endopeptidasa calcio-dependiente altamente específica que escinde el enlace peptídico que es inmediatamente C-terminal con respecto a un par de aminoácidos básicos (es decir, el "sitio KEX2") en un sustrato de proteínas durante la secreción de esa proteína. Las proteínas KEX2 contienen generalmente un residuo de cisteína cerca del residuo de histidina de su sitio activo y son inhibidas mediante p-mercuribenzoato. El miembro fundador de este grupo, la peptidasa KEX2 de S. cerevisiae (Fuller et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1434-1438) , escinde los precursores de toxina killer y feromona factor α durante su secreción.

Se ha informado de la producción de polipéptidos de fusión en varios organismos que incluyen E. coli, levadura y hongos filamentosos. Por ejemplo, se ha producido quimosina bovina en Aspergillus niger como una fusión a glucoamilasa de longitud completa (GAI) (Ward et al., (1990) Bio/technology 8:435 -440; USP

6.265.204 y USP 6.590.078) ; se ha producido interleucina 6 humana (hIL6) en Aspergillus nidulans como una fusión a glucoamilasa de A. niger de longitud completa (GAI) (Contreras et al., (1991) Biotechnology 9:378 -381) ; lisozima de clara de huevo de gallina (Jeenes et al., (1993) FEMS Microbiol. Lett. 107:267 -273) y lactoferrina humana (Ward et al., (1995) Bio/Technology 13:498 -503) se han producido en Aspergillus niger como una fusión a los residuos 1 -498 de glucoamilasa; y se ha producido quimosina bovina en Aspergillus nigger como una fusión con alfa-amilasa nativa de longitud completa (Korman et al., (1990) Curr. Genet. 17: 203-212) y en Aspergillus or y zae como una fusión con formas truncadas de glucoamilasa de A. or y zae (Tsuchiya et al., (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58: 895 -899) . Se hace referencia también a Shoemaker et al., 1981 Bio/Technology 1: 691 -696; Nunberg et al., (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2306 -2315 y Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097 -1102. En algunas de estas proteínas de fusión, se inserta un sitio de reconocimiento de proteasa KEX2 (Lys-Arg) entre una glucoamilasa y una proteína deseada (p.ej., Contreras et al., 1991 y Ward et al., 1995) . Los inventores de la presente invención han descubierto que la secreción de proteína y/o escisión de proteína puede mejorarse en una proteína de fusión cuando el sitio de reconocimiento KEX2 ha sido manipulado para incluir una presecuencia de sitio KEX2 de aminoácidos.

La literatura específica de interés incluye: Ward et al., (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70:2567-2576;

Goller et al., (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64:3202-3208; La Grange et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1036-1044; Bergquist et al., (2002) Biochem. Biotechnol. 100:165-176; Spencer et al., (1998) Eur. J. Biochem. 258:107-112; Jalving et al., (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:363 -368) ; Brenner y Fuller (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:922-926; Durand et al., (1999) Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 208-214; Ahn et al., (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 64:833-839; Gouka et al., (1997) Appl Microbiol Biotechnol. 47:1-11 Broekhuijsen et al.,

(1993) J. Biotechnol. 31:135-145; MacKenzie et al., (1998) J. Biotechnol. 63:137 -146 y las solicitudes de patente publicadas 20040018573 y 20050158825. También USP 4.816.567 y USP 6.331.415 revelan procesos para producir moléculas de inmunoglobulina en células huésped recombinantes. WO 01/18218 describe el uso de la señal de secreción de xilanasa II para aumentar la expresión y secreción de una proteína de interés. WO 90/10075 describe la expresión de polipéptidos de fusión en levadura. Mikosch et al. (Journal of Biotechnology 52

(1996) 97-106) revela la secreción de inhibidor de proteinasa de la mucosa humana activa mediante Aspergillus niger tras el procesamiento similar a KEX2 de una proteína de fusión de inhibidor-glucoamilasa. WO 03/089614 revela la secreción de inmunoglobulina tras el procesamiento similar a KEX2 de una proteína de fusión de inmunoglobulina-glucoamilasa.

Aunque hay numerosos métodos disponibles para la producción de enzimas industriales y proteínas 50 terapéuticas, continúa existiendo una necesidad de métodos alternativos para la producción de proteínas y específicamente para la producción de proteínas terapéuticas, como producción de anticuerpos, lo que resultará en un tiempo de aumento de escala relativamente rápido y altos niveles de proteína producida con riesgo limitado de contaminación mediante agentes virales u otros agentes extraños. La presente invención responde a esta necesidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan un constructo de ADN de fusión, vectores, un polipéptido de fusión, una célula que comprende el constructo de ADN de fusión, y métodos para mejorar la secreción y/o escisión de una proteína deseada desde una célula. Más específicamente, una región KEX2 abarcada por la invención ha sido incluida en un polipéptido de fusión para proporcionar la escisión de una proteína deseada desde el polipéptido de fusión.

Por lo tanto, la invención pertenece a una escisión de proteína de la región KEX2.

Por ello, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un constructo de ADN de fusión que codifica un polipéptido de fusión que comprende en enlace operable desde el extremo 5' de dicho constructo,

un promotor; una primera molécula de ADN que codifica una secuencia señal funcional como una secuencia de secreción en

una célula fúngica filamentosa; una segunda molécula de ADN que codifica una proteína portadora, donde la proteína portadora es un polipéptido fúngico secretado de manera natural o una porción funcional del mismo; una tercera molécula de ADN que codifica una región KEX2, donde la región KEX2 es LAVEKR; y una cuarta molécula de ADN que codifica una proteína deseada.

En otros aspectos, la presente invención proporciona un vector que comprende el constructo de ADN de fusión de la presente invención y una célula huésped que comprende el vector.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un proceso para producir una proteína 20 deseada en una célula fúngica filamentosa que comprende:

(a) obtener una célula huésped fúngica filamentosa que comprende un constructo de ADN de fusión de la presente invención;

(b) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas que permitan la expresión y producción de la

proteína deseada; y 25 (c) recuperar la proteína deseada.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un proceso para aumentar la producción de un anticuerpo a partir de una célula fúngica filamentosa que comprende obtener una célula fúngica filamentosa que comprende un constructo de ADN de fusión de la presente invención, cultivar la célula fúngica en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de fusión y permitir la secreción del polipéptido de fusión, donde la secreción de la proteína deseada es aumentada en comparación con la secreción de un polipéptido de fusión equivalente que no incluye una presecuencia KEX2.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende a partir de un extremo amino-terminal de dicho polipéptido de fusión una primera secuencia de aminoácidos que 35 comprende:

(a) una secuencia señal funcional como secuencia secretora en una célula fúngica filamentosa;

(b) una segunda secuencia de aminoácidos que comprende una proteína portadora, donde la proteína portadora es un polipéptido fúngico secretado de manera natural;

(c) una tercera secuencia de aminoácidos que comprende una región KEX2, donde dicha región es 40 LAVEKR; y

(d) una cuarta secuencia de aminoácidos que comprende una proteína deseada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Determinados aspectos de la descripción detallada a continuación se entienden mejor cuando se leen 45 conjuntamente... [Seguir leyendo]

1. Un constructo de ADN de fusión que codifica un polipéptido de fusión que comprende en unión operable desde el extremo 5' de dicho constructo, un promotor;

una primera molécula de ADN que codifica una secuencia señal funcional como una secuencia secretora en una célula fúngica filamentosa; una segunda molécula de ADN que codifica una proteína portadora, donde la proteína portadora es un polipéptido fúngico secretado de manera natural o una porción funcional del mismo; una tercera molécula de ADN que codifica una región KEX2, donde la región KEX2 es LAVEKR; y

una cuarta molécula de ADN que codifica una proteína deseada.

2. El constructo de ADN de fusión de la reivindicación 1, donde:

(a) la primera molécula de ADN y la segunda molécula de ADN codifican una secuencia señal de CBH1

de Trichoderma y proteína portadora o una secuencia señal de endoglucanasa de Trichoderma y proteína portadora; o (b) la primera molécula de ADN y la segunda molécula de ADN codifican una secuencia señal de glucoamilasa y proteína portadora o una secuencia señal de alfa-amilasa y proteína portadora.

3. El constructo de ADN de fusión de la reivindicación 1, donde la proteína deseada es una enzima o la proteína deseada es una proteína terapéutica.

4. El constructo de ADN de fusión de la reivindicación 3, donde la proteína terapéutica es un anticuerpo o es un anticuerpo monoclonal de cadena pesada o cadena ligera.

5. El constructo de ADN de fusión de la reivindicación 1, donde:

(a) la primera molécula de ADN y segunda molécula de ADN codifican una secuencia señal de CBH1 y proteína portadora y la cuarta molécula de ADN codifica una cadena ligera de anticuerpo o fragmento de la misma; o

(b) la primera molécula de ADN y segunda molécula de ADN codifican una secuencia señal de 30 glucoamilasa y proteína portadora y la cuarta molécula de ADN codifica una cadena ligera de anticuerpo

o fragmento de la misma.

6. La proteína de fusión codificada por el constructo de ADN de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. Un vector que comprende el constructo de ADN de fusión de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la

5.

8. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, donde la célula huésped es una célula huésped de Trichodermca.

10. La célula huésped de la reivindicación 9, donde la célula de Trichoderma es una célula de T. reesei.

11. Un proceso para producir una proteína deseada en una célula fúngica filamentosa que comprende:

(a) obtener una célula huésped fúngica filamentosa que comprende un constructo de ADN de fusión según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5;

(b) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas que permitan la expresión y producción de la

proteína deseada; y 45 (c) recuperar la proteína deseada.

12. Un proceso para escindir una proteína deseada de un polipéptido de fusión recombinante que comprende expresar en una célula fúngica filamentosa un polipéptido de fusión codificado por un constructo de ADN de fusión según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, donde dicha región KEX2 proporciona un sitio de 50 escisión de proteína y obtener una proteína deseada que se escinde del polipéptido de fusión expresado.

13. El proceso según la reivindicación 12, donde la escisión de la proteína deseada se aumenta en comparación con la escisión de dicha proteína deseada de un polipéptido de fusión equivalente que carece de la presecuencia de sitio KEX2.

14. Un proceso para aumentar la producción de un anticuerpo a partir de una célula fúngica filamentosa que comprende obtener una célula fúngica filamentosa que comprende un constructo de ADN de fusión de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, cultivar la célula fúngica en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de fusión y permitir la secreción del polipéptido de fusión, donde la secreción de la proteína deseada se aumenta en comparación con la secreción de un polipéptido de fusión equivalente que no incluye una presecuencia KEX2.

15. El proceso de la reivindicación 14, donde la secreción de la proteína deseada es aumentada en al menos un 30% en comparación con la secreción de la proteína deseada a partir del polipéptido de fusión equivalente.

16. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones de la 11 a la 15, donde:

(a) la proteína deseada es una proteína terapéutica, una inmunoglobulina, un anticuerpo monoclonal; y/o (b) un anticuerpo monoclonal de cadena ligera o cadena pesada o fragmento del mismo.

17. Un polipéptido de fusión que comprende a partir de un extremo amino terminal de dicho polipéptido de fusión 15 una primera secuencia de aminoácidos que comprende:

(a) una secuencia señal funcional como secuencia secretora en una célula fúngica filamentosa;

(b) una segunda secuencia de aminoácidos que comprende una proteína portadora, donde la proteína portadora es un polipéptido fúngico secretado de manera natural;

(c) una tercera secuencia de aminoácidos que comprende una región KEX2, donde dicha región es 20 LAVEKR; y

(d) una cuarta secuencia de aminoácidos que comprende una proteína deseada.

Dibujos Sitio de escisión KEX2 Proteína protadora (enlazador-núcleo CBH1) Proteína deseada (cadena pesada o cadena ligera de

Secuencia señal

Región KEX2

anticuerpo)

Presecuencia de sitio Sitio KEX2 KEX2

Promotor de CBH1Secuencia señal

de CBH1 pTrex4-her2 cadena ligera DNA2.0

Enlazador/núcleo de CBH1

Cadena ligera de Trastuzumab Terminador de CBH1

Secuencia de ADN

de pTrex4-her2 cadena ligera DNA2.0 (10885 bases) (SEQ

ID

NO: 103)

Dímero de fusión de cadena ligera-núcleo CBH1 Fusión de cadena ligera-núcleo CBH1

Dímero de cadenas ligeras Cadena ligera Fusión de cadena ligera-núcleo CBH1 Dímero de cadenas ligeras Cadena ligera Dímero de fusión de cadena ligera-núcleo CBH1

Fusión de cadena ligera-núcleo CBH1

Dímero de cadenas ligeras Cadena ligera Fusión de cadena ligera-enlazador/núcleo CBH1

Dímero de cadenas ligeras Cadena ligera Proteína del huésped de Trichoderma Dímero de fusión de cadena ligera-núcleo CBH1 Fusión de cadena ligera-núcleo CBH1 Dímero de cadenas ligeras Cadena ligera Proteína del huésped de Trichoderma α-glucosidasa Fusión de cadena ligera-enlazador/núcleo de glucoamilasaEnlazador/núcleo-glucoamilasa α-amilasa Cadena ligera