Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN.

Una molécula de ácido nucleico miARN sintético que comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia del miR-101 maduro humano para su uso en la terapia de un cáncer.

Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular. Más particularmente, concierne a procedimientos y composiciones que implican moléculas de ácidos nucleicos que estimulan microARN (miARN) y que inhiben miARN. Se describen los procedimientos y composiciones que implican moléculas sintéticas de miARN y moléculas inhibidoras de miARN. Además, también se describen procedimientos y composiciones para identificar miARN que contribuyen a los procesos celulares. Además, la identificación de miARN que contribuyen a los procesos celulares proporciona dianas para la intervención terapéutica así como el análisis diagnóstico y/o pronóstico.

Descripción de la técnica relacionada

En 2001, varios grupos utilizaron un nuevo procedimiento de clonación para aislar e identificar un gran grupo de microARN (miARN) de C. elegans, Drosophila, y seres humanos (Lagos-Quintana y col., 2001; Lau y col., 2001; Lee y Ambros, 2001). Se han identificado cientos de miARN en plantas y animales -incluyendo seres humanos- en los que no parece haber ARNsi endógenos. Por lo tanto, aunque son similares a los ARNsi, no obstante los miARN son distintos.

Los miARN observados tienen una longitud de aproximadamente 21-22 nucleótidos y provienen de precursores más largos, que ese transcriben a partir de genes que no codifican proteínas. Véase la revisión de Carrington y col. (2003). Las formas precursoras forman estructuras que se pliegan unas sobre otras; son procesadas por la nucleasa Dicer en los animales o DCL1 en las plantas. Las moléculas de miARN interrumpen la traducción por medio del emparejamiento de bases preciso o impreciso con sus dianas.

Unos miARN parece que están implicados en la regulación genética. Algunos miARN, que incluyen lin-4 y let-7 inhiben la síntesis proteica uniéndose a regiones 3 sin traducir (3 UTR) complementarias de los ARNm diana. Otros, incluyendo el miARN Scarecrow que se encuentra en plantas, funcionan como el ARNsi y se unen a secuencias de ARNm perfectamente complementarias para destruir la transcripción diana (Grishok y col., 2001).

La investigación en microARN se incrementa según los científicos están empezando a apreciar el amplio papel que estas moléculas tienen en la regulación de la expresión genética en eucariotas. Los dos miARN mejor conocidos, lin- 4 y let-7, regulan el tiempo de desarrollo en C. elegans regulando la traducción de una familia de ARNm clave (revisado en Pasquinelli, 2002). Se han identificado varios cientos de miARN en C. elegans, Drosophila, ratón y seres humanos. Como sería de esperar en moléculas que regulan la expresión genética, los niveles de miARN muestran una variación entre tejidos y estadios de desarrollo. Además, un estudio muestra una fuerte correlación entre la expresión reducida de dos miARN y la leucemia linfocítica crónica, proporcionando un posible enlace entre los miARN y el cáncer (Calin, 2002). Aunque el campo aún es joven, hay una especulación sobre que los miARN podrían ser factores de transcripción importantes en la regulación de la expresión genética en eucariotas superiores.

Hay unos pocos ejemplos de que los miARN tienen papeles críticos en la diferenciación celular, el desarrollo temprano, y los procesos celulares tales como apoptosis y metabolismo de las grasas. Tanto lin-4 como let-7 regulan el paso de un estado larvario a otro durante el desarrollo de C. elegans (Ambros, 2003). El mir-15 y bantam son los miARN de Drosophila que regulan la muerte celular, aparentemente regulando la expresión de los genes implicados en la apoptosis (Brennecke y col., 2003, Xu y col., 2003). El miR14 también se ha implicado en el metabolismo graso (Xu y col., 2003). El Lsy-6 y miR-273 son miARN de C. elegans que regulan la asimetría en las neuronas quimiosensoriales (Chang y col., 2004). Otro miARN animal que regula la diferenciación celular es el miR-181, que dirige la diferenciación de células hematopoyéticas (Chen y col., 2004). Estas moléculas representan el intervalo total de miARN animales con funciones conocidas. Además, el documento WO 2005/079397 desvela el miARN miR- 215. La mejora del entendimiento de las funciones de los miARN sin duda revelará sistemas reguladores que contribuyen al desarrollo normal, diferenciación, comunicaciones Ínter e intra celulares, ciclo celular, angiogénesis, apoptosis, y muchos otros procesos celulares. Debido a sus importantes papeles en muchas funciones biológicas, es probable que los miARN ofrezcan puntos importantes para la intervención terapéutica o el análisis diagnóstico.

Caracterizar las funciones de biomoléculas como los miARN a menudo implica la introducción de las moléculas en las células o retirar las moléculas de las células y medir el resultado. Si se introduce un miARN en una célula y se produce apoptosis, entonces el miARN indudablemente participa en una ruta apoptótica. Los procedimientos para introducir y retirar miARN de las células se han descrito. Dos publicaciones recientes describen moléculas antisentido que se pueden utilizar para inhibir la actividad de miARN específicos (Meister y col., 2004; Hutvagner y col., 2004). Otra publicación describe el uso de plásmidos que se transcriben por ARN polimerasas y que producen miARN específicos cuando son transfectados en las células (Zeng y col., 2002). Estos dos grupos de reactivos se han utilizado para evaluar miARN sencillos.

Una limitación del sistema de expresión de miARN basado en plásmidos es que la eficacia de transfección de los plásmidos tiende a ser muy baja, con solo aproximadamente un 50% de células que expresan el ARN del plásmido

en las células que son fáciles de transfectar. La eficacia de transfección para los plásmidos en células primarias son mucho más bajas con poco más del 10% de las células típicamente que expresan el ARN deseado. Por lo tanto, existe una necesidad para composiciones alternativas y procedimientos para introducir moléculas de miARN en células de forma que se puedan caracterizar y estudiar.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico miARN sintético que comprende una secuencia con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia del miR-215 humano maduro para su uso en una terapia de un cáncer. También se proporciona un ácido nucleico miARN sintético de doble cadena de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia de miR-215 maduro que comprende los nucleótidos 27-47 de las SEC ID N2 162, y un segundo polinucleótido por separado cuya secuencia de 5 a 3 es entre un 60% y el 100% complementaria para su uso como un medicamento.

También se proporciona el uso de un ácido nucleico miARN sintético como se ha mencionado anteriormente para reducir o aumentar la viabilidad celular o la proliferación celular o para inducir apoptosis, con la condición de que se excluyan procedimientos de tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de terapia. Más realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones. La siguiente descripción detallada se refiere a la presente invención en la medida del alcance de las reivindicaciones.

El término miARN se utiliza de acuerdo con su significado habitual y simple y se refiere a una molécula de microARN que se encuentra en las eucariotas que está implicada en la regulación genética basada en ARN. Véase, por ejemplo Carrington y col., 2003, que se incorpora en el presente documento por referencia. Generalmente, el término se utilizará para referirse a la molécula de ARN de cadena sencilla procesada a partir de un precursor. Se han identificado miARN individuales y se han secuenciado en distintos organismos, y se les ha dado nombres. Los nombres de los miARN y sus secuencias se proporcionan en el presente documento.

La presente invención se refiere, en algunas realizaciones de la invención, a moléculas cortas de ácido nucleico que funcionan como miARN o como inhibidores de miARN en una célula. El término corto se refiere a una longitud de un nucleótido simple que tenga 150 nucleótidos o poco más. Las moléculas de ácido nucleico son sintéticas. El término sintético significa que la molécula de ácido nucleico es aislada y no es idéntica a la secuencia (la secuencia entera) y/o estructura química a una molécula de ácido nucleico de origen natural, tal como una molécula precursora de miARN endógeno. Aunque en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención no tienen una secuencia entera que es idéntica a una secuencia de un ácido nucleico... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico miARN sintético que comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos un 80% con la secuencia del miR-215 maduro humano para su uso en la terapia de un cáncer.

2. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 que además se define como una molécula de ácido nucleico de entre 17 y 125 restos de longitud, que comprende

una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es al menos idéntica en un 80% a un miARN maduro miR-215, y

una región complementaria cuya secuencia de 5 a 3 es complementaria entre un 60% y el 100% a la región de miARN.

3. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es idéntica en al menos un 85% a una secuencia de miR-215 maduro.

4. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es idéntica en al menos un 90% a una secuencia de miR-215 maduro.

5. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, que comprende una región de miARN cuya secuencia de 5 a 3 es idéntica a una secuencia de miR-215 maduro.

6. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ácido nucleico está comprendido por dos polinucleótidos separados.

7. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el ácido nucleico es una molécula en horquilla.

8. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su administración a una célula o a un paciente que tiene la célula identificada como que necesita una terapia de un cáncer.

9. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso en una terapia de un cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en una terapia de tratamiento de un cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de cuello uterino o cáncer de piel.

10. Un ácido nucleico miARN sintético de cadena doble de 17-30 nucleótidos de longitud que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia con una identidad de secuencia de al menos un 80% con una secuencia de miR-215 maduro que comprende los nucleótidos 27-47 de la SEC ID N2 162, y un segundo polinucleótido separado cuya secuencia de 5 a 3 es complementaria entre un 60% y el 100% con el primer polinucleótido, para su uso como un medicamento.

11. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 10, que se caracteriza porque el ácido nucleico está definido además como en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.

12. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 que comprende además uno o más de los siguientes:

(i) un grupo de sustitución del fosfato o el hidroxilo del nucleótido en el extremo 5 de la cadena complementaria de la molécula de ARN;

(ii) una o más modificaciones en los azúcares de los primeros o últimos 1 a 6 restos de la región complementaria; o

(iii) una no complementariedad entre uno o más nucleótidos de los últimos 1 a 5 restos del extremo 3 de la región complementaria y los correspondientes nucleótidos de la región miARN.

13. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, que comprende i) al menos un nucleótido modificado que bloquea el OH 5 o fosfato en el extremo 5, en el que la modificación del al menos un nucleótido es un NH2, biotina, un grupo amino, un grupo alquilamino inferior, un grupo acetilo o una modificación 2 oxígeno-metilo (2 O-Me), o ¡i) al menos una modificación de la ribosa seleccionada de entre 2'F, 2NH2, 2'N3, 4'tio, o 2 O-CH3.

14. Un ácido nucleico miARN sintético para su uso como un medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 que es un polinucleótido de cadena sencilla, o un polinucleótido de cadena doble.

15. El uso de un ácido nucleico miARN sintético como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la reducción o el aumento de la viabilidad celular o la proliferación celular o la inducción de la apoptosis, con la

condición de que se excluyan los procedimientos para el tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de cirugía como terapia.