Método para la detección multidimensional de fenotipos aberrantes en células neoplásicas para su uso para monitorizar niveles mínimos de enfermedad utilizando citometría de flujo.

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la detección de fenotipos aberrantes expresados por células neoplásicas de muestras de médula ósea,

sangre, líquido cefalorraquídeo y ganglios linfáticos. La invención comprende una serie de pasos, donde este procedimiento simula experimentos de dilución de células neoplásicas en una muestra normal mediante el uso de procedimientos computacionales y podría emplearse combinando directamente la información de dos o más archivos de datos distintos o bien tras ajustar la posición relativa de las poblaciones celulares según estándares predefinidos.

Método para la detección multidimensional de fenotipos aberrantes en células neoplásicas para su uso para monitorizar niveles mínimos de enfermedad utilizando citometría de flujo.

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la de la solicitud provisional con Nº de serie 60/451, 738 presentada el 4 de marzo de 2003.

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el campo de la citometría de flujo y más particularmente con la detección 15 secuencial de patrones aberrantes de expresión de proteínas en células neoplásicas y la identificación de números mínimos de células neoplásicas presentes entre una población mayoritaria de células normales en muestras de sangre, médula ósea, líquido cefalorraquídeo y ganglios linfáticos. La invención posibilita: 1) la identificación inequívoca de los fenotipos aberrantes presentes en células neoplásicas que permita su identificación sensible y específica, 2) la estimación de su utilidad para identificar números mínimos de células neoplásicas que presenten 20 fenotipos aberrantes idénticos a los observados inicialmente en otra muestra del mismo individuo obtenida simultáneamente o posteriormente, y 3) el cálculo de la distribución de células neoplásicas en muestras de sangre, médula ósea, líquido cefalorraquídeo y ganglios linfáticos, tanto en términos del porcentaje de células como del número de células por microlitro de muestra, a través del análisis multiparamétrico por citometría de flujo de las células presentes en una muestra marcada con múltiples combinaciones de anticuerpos monoclonales mezclados 25 con una suspensión de microperlas (micropartículas) en cantidad conocida.

2. Antecedentes de la invención

En la Patente de EE.UU. Nº 5.047.321, Loken y Terstappen describen el análisis multiparamétrico de los 30 componentes celulares presentes en un líquido corporal. Los líquidos corporales descritos incluyen sangre y médula ósea. Utilizando una combinación de dos colorantes de ácidos nucleicos, un anticuerpo monoclonal marcado con fluorescencia y dos parámetros de dispersión de luz, Loken y Terstappen fueron capaces de distinguir entre varios componentes celulares de sangre y médula ósea, contar el número de células dentro de cada uno de estos componentes y proporcionar un análisis diferencial de cada uno de estos compartimientos celulares. A través de la 35 tinción combinada con el colorante de ADN, LDS-751 (Exciton) , con el colorante de ARN, naranja de tiazol (TO, Molecular Probes, Inc) y con un anticuerpo monoclonal anti-CD45 marcado con fluorescencia, junto con la medición de la dispersión frontal y lateral de luz en aspirados de sangre completa y médula ósea, estos autores fueron capaces de identificar y diferenciar entre células eritroides nucleadas, eritrocitos, reticulocitos, plaquetas, linfocitos, monocitos, granulocitos neutrófilos, granulocitos basófilos, granulocitos eosinófilos y precursores de todas las células 40 nucleadas. Sin embargo, no pudieron demostrar la capacidad de este enfoque para diferenciar específicamente entre células normales y células neoplásicas que coexistan en la misma muestra.

En la Patente de EE.UU. Nº 6.287.791, Terstappen y Chen describen con más detalle algunos aspectos de la Patente de EE.UU. Nº 5.047.321, pero no demostraron ninguna caracterización mejor de las distintas poblaciones de 45 leucocitos.

En la Patente de EE.UU. Nº 5.137.809, Loken y Sha describen el análisis multiparamétrico de componentes celulares en la médula ósea. En una primera etapa, los autores describen el uso de una combinación de anticuerpos monoclonales marcados, cada uno de ellos, con un fluorocromo distinto, para teñir todos los leucocitos y, en una 50 segunda etapa, combinaciones adicionales para teñir poblaciones de leucocitos seleccionadas.

Todos los métodos descritos anteriormente fueron capaces de identificar varias poblaciones de leucocitos normales en muestras de sangre y médula ósea e identificaron solamente las subpoblaciones seleccionadas, tal y como se identifican por medio de la combinación específica de anticuerpos monoclonales y colorantes de ácidos nucleicos 55 usados; sin embargo, no fueron capaces de ofrecer un enfoque para la identificación específica y reproducible de células neoplásicas mezcladas en una muestra de forma natural o artificialmente con células normales. Además estos enfoques permiten la enumeración de las subpoblaciones de leucocitos normales identificadas en cuanto al porcentaje de leucocitos totales. Por otra parte, el uso de estos métodos no permite relacionar fácilmente ni comparar directamente la información sobre la cantidad de luz dispersada y de fluorescencia medidas para las 60 células contenidas en una primera muestra con las de las células contenidas en una segunda muestra diferente, especialmente si estas provienen de tejidos distintos del mismo individuo, de individuos distintos o si se han medido en condiciones distintas.

En la Patente de EE.UU. Nº 5.627.037, Ward et al proponen una técnica en una sola etapa para calcular el número 65 de una o más poblaciones de células que se encuentran en un volumen conocido de una muestra de sangre. Este enfoque emplea una mezcla de reactivos que contiene una mezcla de uno o más marcadores celulares, una micropartícula cuantificada por fluorescencia y un fijador. La técnica descrita por Ward et al permite calcular los recuentos absolutos de leucocitos, tales como células T CD4+, pero no ofrece ninguna indicación específica sobre el procedimiento exacto a aplicar para la enumeración de subpoblaciones individuales de leucocitos de sangre.

En la última década se han publicado muchos estudios que demuestran que las células neoplásicas de una gran mayoría de pacientes que padecen enfermedades hematológicas malignas muestran patrones aberrantes de expresión de antígenos detectables mediante el uso de diferentes combinaciones triples y cuádruples de anticuerpos monoclonales analizadas mediante citometría de flujo (Revisado en Vidríales et al. Best Clin Res Pract, 2003; 16:599-612) . Estos patrones anómalos de expresión de antígenos nunca se detectan en células normales e incluyen 10 uno o más de los siguientes subtipos: 1) expresión de antígenos en linajes cruzados, 2) expresión asincrónica de antígenos, 3) sobreexpresión e infraexpresión de antígenos, 4) propiedades de dispersión de luz anormalmente elevadas o bajas, y 5) fenotipos ectópicos. Basándose en estas anomalías se han propuesto varios paneles específicos del tipo de enfermedad de combinaciones de reactivos de anticuerpos monoclonales de tres y cuatro colores, para así poder identificar de forma sistemática células leucémicas que expresen fenotipos aberrantes, en 15 prácticamente cualquier paciente con leucemia linfoblástica aguda de células B precursoras (LLA-CBP; Lucio et al, Leukemia, 2001; 15: 1185-1192) , LLA-T (Porwit-MacDonaid, Leukemia, 2000; 14: 816-825) , leucemia mieloblástica aguda (LMA; San Miguel et al, Blood, 2001; 98: 1746-1751) , leucemia linfocítica crónica de células B (Rawstrom et al, Blood, 2001; 98: 29-35) y otros trastornos linfoproliferativos crónicos de células B (Sánchez et al, Leukemia, 2002; 16: 1460-1469) , entre otras enfermedades. 20

En todos los enfoques descritos hasta ahora para la identificación de fenotipos aberrantes expresados por células neoplásicas, la interpretación de los resultados la realiza una persona experimentada, con amplio conocimiento de los patrones de expresión de proteínas en células normales. Mediante este enfoque se ha demostrado que las células neoplásicas de pacientes estudiados en el momento del diagnóstico y en el momento de la recaída, 25 habitualmente muestran más de un fenotipo aberrante, especialmente si se emplean para su identificación paneles relativamente amplios de combinaciones triples y cuádruples de anticuerpos monoclonales. Basándonos en todos los fenotipos aberrantes detectados en el diagnóstico, se diseñan y prueban nuevas combinaciones, en 3 o 4 colores, de anticuerpos monoclonales para la investigación de forma específica de estos fenotipos específicos de las células neoplásicas para su uso posterior en la búsqueda de la infiltración mínima por células neoplásicas en otras 30 muestras que se obtengan simultáneamente (por ejemplo, por razones de estadificación) o a posteriori (por ejemplo, para monitorizar la enfermedad y la terapia) . Sin embargo, la necesidad de que los resultados sean interpretados por una persona experta con amplio conocimiento y experiencia de los patrones diferenciales de expresión de proteínas observadas entre... [Seguir leyendo]

1. Un método para la identificación de fenotipos aberrantes, en el que los fenotipos aberrantes se refieren a patrones de expresión de proteínas en células neoplásicas que difieren del patrón de las células normales o reactivas no neoplásicas, en el que el método comprende las etapas de:

a) teñir por separado una o más muestras normales/reactivas y una población de micropartículas de referencia, y 5 una muestra neoplásica y una población de micropartículas de referencia con múltiples combinaciones solapantes de al menos cuatro anticuerpos monoclonales, estando cada anticuerpo monoclonal en cada combinación conjugado a un fluorocromo distinto, y teniendo en común cada combinación al menos tres anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo, siendo dichos anticuerpos monoclonales capaces de reconocer un antígeno diferente que se expresa en distintas cantidades en las diversas poblaciones de leucocitos y en las poblaciones de células 10 neoplásicas de una muestra;

b) medir secuencialmente al menos dos dispersiones de la luz y al menos cuatro emisiones fluorescentes distintas asociadas a un gran número de células teñidas con cada una de las combinaciones de anticuerpos monoclonales de las muestras normales/reactivas y la muestra neoplásica y de dichas poblaciones de micropartículas de referencia, usando citometría de flujo; 15

c) almacenar dos archivos independientes de datos en forma de listado, conteniendo uno la información obtenida tal como se describe en la etapa (b) acerca de las características específicas de dispersión de luz y de fluorescencia de cada célula y micropartícula de referencia analizadas a partir de las muestras normales/reactivas y conteniendo el otro la información obtenida tal como se describe en la etapa (b) acerca de las características específicas de dispersión de luz y de fluorescencia de cada célula y micropartícula de referencia analizadas a partir de la muestra 20 neoplásica;

d) crear nuevos archivos de datos fusionando en proporciones conocidas los eventos celulares y los eventos de las micropartículas de referencia del archivo de datos que contiene la información de la luz dispersada y la fluorescencia obtenida tal como se describe en la etapa (b) acerca de las células y micropartículas de referencia presentes en la muestra neoplásica en el archivo de datos que contiene la información obtenida tal como se describe en la etapa (b) 25 acerca de las células y las micropartículas de referencia presentes en las muestras normales/reactivas; en el que la información de dos archivos de datos distintos se fusiona tras ajustar una posición relativa de las poblaciones de eventos celulares medidas según las micropartículas de referencia;

e) definir en un espacio multidimensional generado por las medidas de luz dispersada y de emisiones fluorescentes mediante citometría de flujo, aquellas áreas ocupadas por los eventos que corresponden a células normales y 30 aquellas áreas que corresponden a espacios vacíos en las muestras normales/reactivas y que puedan estar ocupadas por células tumorales presentes en muestras neoplásicas;

f) identificar secuencialmente en los archivos de datos fusionados como se describe en la etapa d) , aquellos eventos que corresponden a células neoplásicas como distintos de los eventos que corresponden a células normales que coexisten en un espacio multidimensional generado por las medidas de luz dispersada y emisiones de fluorescencia 35 mediante citometría de flujo; y

g) establecer las aberraciones fenotípicas más relevantes mostradas en las células neoplásicas en comparación sus homólogos normales, que permiten su identificación inequívoca, sensible y específica en el archivo de datos fusionado.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las muestras comprenden sangre periférica.

3. El método de la reivindicación 1, en el que las muestras comprenden médula ósea.

4. El método de la reivindicación 1, en el que las muestras comprenden líquido cefalorraquídeo. 45

5. El método de la reivindicación 1, en el que las muestras comprenden ganglios linfáticos.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se tiñe más de una muestra normal seleccionada al azar. 50

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se tiñe más de una muestra normal, seleccionándose todas las muestras normales de un grupo de edad de individuos bien definido, o de cualquier otro grupo de individuos definido según su género y sus estados no neoplásicos subyacentes.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las muestras neoplásicas contienen células tumorales hematopoyéticas de uno o más tipos distintos.

9. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8, en el que las muestras neoplásicas contienen células tumorales no hematopoyéticas de uno o más tipos distintos. 60

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 9, en el que las muestras neoplásicas contienen células neoplásicas hematopoyéticas y células tumorales no hematopoyéticas.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 10, en el que las muestras neoplásicas se 65

obtienen en el primer diagnóstico, en la recaída y en cualquier periodo de tiempo posterior al diagnóstico.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 11, en el que las muestras neoplásicas pueden contener un número elevado o mínimo de células neoplásicas.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las muestras se tiñen directamente después de obtenerse.

14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las muestras se tiñen tras ser cultivadas in vitro. 10

15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los paneles de combinaciones múltiples de anticuerpos monoclonales utilizados para teñir las muestras neoplásicas y las muestras normales/reactivas son idénticos.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el panel de combinaciones múltiples de anticuerpos monoclonales utilizado para teñir las muestras neoplásicas, es más reducido que el panel de combinaciones de anticuerpos monoclonales utilizado para teñir las muestras normales/reactivas, pero el primer panel se encuentra incluido completamente en el último.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que para cada par de paneles de combinaciones de anticuerpos monoclonales, un clon exacto de cada anticuerpo monoclonal usado en cada combinación individual de anticuerpos monoclonales, y un fluorocromo al que está conjugado, son idénticos en los dos paneles de combinaciones de anticuerpos monoclonales.

18. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una combinación de fluorocromos compatibles se selecciona de isotiocianato de fluoresceína (FITC) , ficoeritrina (PE) , proteína peridina clorofila (PerCP) , aloficocianina, alexa flúor 488, alexa 647, pacific blue, alexa flúor 405, cianina 5 (Cy5) , cianina 5.5 (Cy5.5) y conjugados de los mismos acoplados con PE, con APC o con PerCP (PE/Cy5, PE/Cy5.5, PE/Cy7, APC/Cy7 y PerCP/Cy5.5) o cualquier fluorocromo o conjugados de fluorocromo compatibles adicionales. 30

19. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la información de la luz dispersada y la fluorescencia medidas de aquellos eventos teñidos con cada combinación de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos contenidos en un panel utilizado para teñir diferentes alícuotas repetidas de la misma muestra se almacenan inicialmente en archivos de datos separados. 35

20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la información de la luz dispersada y la fluorescencia medidas de aquellos eventos teñidos con todas las distintas combinaciones de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos contenidos en un panel utilizado para teñir diferentes alícuotas repetidas de la misma muestra se almacenan en un único archivo de datos. 40

21. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que la información de dos archivos de datos distintos se fusiona directamente sin ninguna corrección.

22. Un método según la reivindicación 1, en el que la población de micropartículas de referencia es uniforme. 45

23. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 22, en el que una población de micropartículas de referencia se compone de múltiples poblaciones de microperlas de distinto tamaño, densidad, volumen, forma, cantidad de fluorescencia, características de adhesión u otras propiedades fisicoquímicas.

24. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 22 a 23, en el que una población de micropartículas se compone de partículas fluorescentes.

25. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 22 a 23, en el que una población de micropartículas se compone de micropartículas cuya superficie está cubierta con anticuerpos anti-inmunoglobulina. 55

26. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 22 a 23, en el que una población de micropartículas se compone de una mezcla de micropartículas fluorescentes cuya superficie está cubierta con anticuerpos anti-inmunoglobulina.

27. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 22 a 26, en el que las micropartículas se añaden en números conocidos.

28. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las diluciones en serie de los eventos a partir de un archivo de datos correspondiente a una muestra neoplásica teñida con un panel de combinaciones de 65 anticuerpos monoclonales múltiples en un archivo de datos que contiene información sobre las medidas de la luz

dispersada y de fluorescencia de las células contenidas en una o más de las muestras normales/reactivas teñidas con un panel idéntico de anticuerpos monoclonales, se realiza en la etapa (d) del procedimiento descrito en la reivindicación 1, para evaluar la sensibilidad a la cual un número pequeño de células neoplásicas se podría detectar una vez diluido en células normales/reactivas a proporciones conocidas predefinidas.

29. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que se detectan patrones anormales de expresión de antígenos relacionados con activación celular y con una función celular.