Protección de proteínas KRP mutantes negativas dominantes contra la inhibición activa del complejo ciclina-CDK por parte de KRP de tipo salvaje.

Un polipéptido inhibidor de quinasa dependiente de ciclina de plantas (CKI) mutante que comprende:

una secuencia de aminoácidos CKI que tiene al menos dos modificaciones de aminoácidos relativas a un polipéptido CKI de plantas de tipo salvaje, en donde dicho polipéptido CKI de tipo salvaje comprende

(a) Una región de unión a la ciclina que confiere una afinidad de unión a una ciclina y

(b) una región de unión a una quinasa dependiente de ciclinas (CDK) que confiere una afinidad de unión a la CDK; en donde el polipéptido CKI de tipo salvaje se une a un complejo ciclina/CDK;

en donde las dos modificaciones que hay por lo menos se encuentran dentro de la región de unión a la CDK;

en donde el polipéptido CKI mutante puede competir con dicho CKI de tipo salvaje por unirse al complejo ciclina/CDK;

en donde dicho polipéptido CKI de plantas de tipo salvaje es miembro de la familia de las proteínas relacionadas con KIP (KRP) y en donde dicho polipéptido CKI de plantas mutante no inhibe la actividad quinasa del complejo ciclina/CDK; y

en donde las dos modificaciones que hay por lo menos antedichas se encuentran dentro de la región correspondiente a los aminoácidos 145-168 de la KRP1 de Brassica (BnKRP1), estando cada sustitución de aminoácidos en una posición seleccionada independientemente del grupo que consiste en:

(a) (a) una posición correspondiente al aminoácido 145 de la BnKRP1;

(b) (a) una posición correspondiente al aminoácido 149 de la BnKRP1;

(c) (a) una posición correspondiente al aminoácido 151 de la BnKRP1;

(d) (a) una posición correspondiente al aminoácido 153 de la BnKRP1;

(e) (a) una posición correspondiente al aminoácido 164 de la BnKRP1; y

(f) (a) una posición correspondiente al aminoácido 165 de la BnKRP1.

Protección de proteínas krp mutantes negativas dominantes contra la inhibición activa del complejo ciclina-cdk por parte de krp de tipo salvaje Solicitudes relacionadas [0001] Esta solicitud reivindica prioridad frente a la Solicitud Estadounidense nº . 60/703.999, presentada el 29 de julio de 2005.

Antecedentes de la invención [0002] Las plantas tienen el mismo ciclo celular básico que las células eucariotas. No es extraño que también tengan algo en común con las quinasas eucariotas denominadas quinasas dependientes de ciclinas (CDK) que regulan las transiciones entre las diferentes fases del ciclo celular. La Arabidopsis, un sistema de planta modelo utilizado para estudiar el ciclo celular tiene varios subgrupos de CDK. El CDKA es el más parecido a la cdc2 (CDK1) de los mamíferos y contiene la secuencia de aminoácidos altamente conservada Pro Ser Thr Ala Ile Arg Glu (PSTAIRE) (SEC ID Nº .:1) en una región que media la interacción con su parte de ciclina. La Arabidopsis también tiene un grupo de CDK específico para las plantas denominado CDKB que no se conserva en los animales superiores. Sin embargo, a las plantas les falta la contraparte de los mamíferos en las G1 CDK: las CDK4 y las CDK6. Se ha propuesto que el CDKA sea la G1 CDK (que es activada por las ciclinas tipo D de las plantas) , al tiempo que ha quedado demostrado que el CDKB se expresa sobre todo en la fase S y posteriores y, por lo tanto, probablemente se le podría identificar como la CDK específica a las G2/M.

La activación/desactivación de estas CDK impulsa a las células hacia el ciclo celular y también determina cuándo deben abandonar las células el ciclo celular. La Arabidopsis contiene hasta 49 ciclinas agrupadas en 10 subclases (véase Wang et al., Plant Physiol. 135:1084-1099, 2004) . Parece que solo las clases A, B y D influyen en el ciclo celular y activan las CDK (Wang et al., Plant Physiol. 135:1084-1099, 2004) . El CDKA es activado por las ciclinas tipo D mientras que el CDKB es activado por las ciclinas tipo A y B.

En los animales, las CDK son reguladas negativamente por dos familias de inhibidores de CDK (CKI) . Una clase, denominada inhibidor de CDK4 (INK4) se compone de 4 miembros (p15, p16, p18 y p19) que se unen a y evitan que las G1 CDK, a saber, la CDK4 y la CDK6, se unan a la ciclina. Al otro grupo de inhibidores se le denomina Proteínas Inhibidoras de Quinasas (KIP) o proteínas CIP (Proteína que Interactúa con CDK) y se conservan altamente en todos los animales. La familia CIP/KIP inhibe principalmente la actividad quinasa de los complejos ciclina A y E-CDK2. En las plantas, se han identificado CKI putativos (Wang et al., Nature 386:451-452, 1997; Wang et al., Plant J. 15:501-510, 1998; De Veylder et al., Plant Cell 13:1653-1667, 2001; Jasinski et al., Plant Physiol. 130:1871-1882, 2002) y han demostrado inhibir in vitro la actividad quinasa de los complejos ciclina/CDK purificados (Wang et al., 1997, supra; Wang et al., Plant J. 24:613-623, 2000; Lui et al., Plant J. 21:379-385, 2000) . La expresión de los CKI de las plantas demostró un crecimiento reducido con órganos más pequeños que contienen células mayores (véase Wang et al., 2000, supra; Jasinski et al., J. Cell Sci. 115:973-982, 2001; De Veylder et al., supra; Zhou et al., Plant Cell Rep. 20:967-975, 2002; Zhou et al., Plant J. 35:476-489, 2003; Schnittger et al., Plant Cell 15:303-315, 2003) . En la Arabidopsis, a estos CKI se les denomina Inhibidores de CDK (ICK) o proteínas relacionadas con KIP (KRP) . Se han identificado siete miembros de la familia de los ICK que son los que más se asemejan a la familia de las CIP/KIP de los CKI. Cada uno de estos miembros de la familia de las ICK/KRP tiene una alta identidad de secuencia de aminoácidos con el p27KIP1 pero la identidad está limitada a los 30 últimos aminoácidos del extremo C-terminal. Hasta la fecha, no se ha identificado ningún CKI relacionado con la INK en ninguna planta.

La sobreexpresión de las ciclinas o pérdidas de expresión de los CKI ilustran que el bien equilibrado motor del ciclo celular puede verse fácilmente perturbado en el caso de los mamíferos. Este desequilibrio puede llevar en último término a ciclos celulares acelerados, un aumento del tamaño de los animales y/o el desarrollo de tumores. La reducción o eliminación completa de la "actividad" de los CKI resulta en un aumento de la actividad quinasa del complejo ciclina/CDK. Este aumento de actividad resulta en la fosforilación de las dianas subsiguientes necesarias para la progresión del ciclo celular y en los animales lleva, en última instancia, a una hiperproliferación celular (Coats et al., Science 272:877-880, 1996) . La deleción del gen p27KIP1 en ratones da como resultado ratones de mayor tamaño debido a una actividad excesiva del complejo ciclina/cdk que lleva a una proliferación celular excesiva (Fero et al., Cell 85:733-744, 1996; Kiyokawa et al., Cell 85:721-732, 1996; Nakayama et al., Cell 85:707-720, 1996) .

Existen mecanismos para suprimir la expresión de varios miembros de la familia de las KRP. El silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) en las plantas es un mecanismo de degradación del ARN parecido al de la interferencia de ARN (ARNi) en animales. La ARNi resulta en la degradación específica al ARN de doble cadena (dsARN) en fragmentos cortos de dsARN de 21-23 pb que en última instancia influyen en la degradación de una población de ARN homólogos. En las plantas, la PTGS utiliza una estrategia de repeticiones

invertidas (IR) para suprimir la expresión génica en muchas especies de plantas, incluyendo las plantas de cultivo tales como el maíz, la soja y la colza por nombrar algunas. No obstante, la tecnología de las IR tiene varias desventajas como la eficiencia de la secuencia de las IR, la regulación génica fuera de las dianas (Jackson et al., Nature Biotech. 21:635-637, 2003) , el silenciamiento transitorio, la estabilidad general de las IR, y análogos. Estas desventajas se ven agravadas en este caso por la necesidad de silenciar más de un gen a la vez.

La mejora del cultivo vegetal convencional ha sido la principal fuerza impulsora del aumento del rendimiento de los cultivos en los últimos 75 años (J. Fernandez-Cornejo, Agriculture Information Bulletin Nº . (AIB786) , pág. 81, febrero de 2004) . Más recientemente, hay disponibles cultivos transgénicos que, por ejemplo, son resistentes a las plagas de insectos y a los herbicidas. No obstante, estos cultivos transgénicos vienen acompañados de una penalización sobre el rendimiento (Elmore et al., Agron. J. 93:408-412, 2001; Elmore et al., Agron. J. 93:404-407, 2001) . Hasta la fecha, no hay ningún cultivo transgénico conocido en el comercio que provoque un aumento en el tamaño de las semillas o un aumento en el rendimiento de los cultivos.

Existe una necesidad en el estado de la técnica de métodos mejorados para modificar las características de ciertos cultivos de valor comercial, incluyendo por ejemplo, aunque no exclusivamente, el aumento del rendimiento de los cultivos, el aumento del tamaño de las semillas, el aumento del porcentaje de germinación, el aumento de la masa radicular y similares. La presente invención, tal como aquí se describe, satisface estas y otras necesidades.

Breve resumen de la invención [0009] La presente invención proporciona un polipéptido inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas (CKI) variante de plantas conforme a las reivindicaciones, que tiene al menos dos modificaciones relativas a un polipéptido CKI de tipo salvaje. Al menos una de las modificaciones se encuentra dentro de la región de unión a la CDK para así conferir, respecto a la proteína CKI de tipo salvaje, una afinidad de unión modificada a la proteína CDK, manteniendo al mismo tiempo una afinidad de unión a una proteína ciclina. Los polipéptidos CKI variantes de la presente invención tienen una actividad antagonista negativa dominante contra la función de los CKI de tipo salvaje. Cuando la variante se expresa dentro de una célula que expresa la proteína CKI de tipo salvaje correspondiente, o una célula que expresa un CKI de tipo salvaje heterólogo a la proteína de tipo salvaje correspondiente pero que sustancialmente tiene una unión de tipo salvaje equivalente respecto a, entre otras, una unión a la ciclina y a la CDK, la actividad biológica del CKI de tipo salvaje queda inhibida, lo que lleva a una progresión acelerada a través del ciclo celular y a una mayor proliferación celular.

En otros aspectos, la presente invención proporciona un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido CKI variante conforme a las reivindicaciones, o un vector que comprende el ácido nucleico recombinante. El ácido nucleico que codifica el CKI variante o vector puede introducirse... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido inhibidor de quinasa dependiente de ciclina de plantas (CKI) mutante que comprende: una secuencia de aminoácidos CKI que tiene al menos dos modificaciones de aminoácidos relativas a un polipéptido CKI de plantas de tipo salvaje, en donde dicho polipéptido CKI de tipo salvaje comprende (a) Una región de unión a la ciclina que confiere una afinidad de unión a una ciclina y

(b) una región de unión a una quinasa dependiente de ciclinas (CDK) que confiere una afinidad de unión a la CDK; en donde el polipéptido CKI de tipo salvaje se une a un complejo ciclina/CDK; en donde las dos modificaciones que hay por lo menos se encuentran dentro de la región de unión a la CDK; en donde el polipéptido CKI mutante puede competir con dicho CKI de tipo salvaje por unirse al complejo

ciclina/CDK; en donde dicho polipéptido CKI de plantas de tipo salvaje es miembro de la familia de las proteínas relacionadas con KIP (KRP) y en donde dicho polipéptido CKI de plantas mutante no inhibe la actividad quinasa del complejo ciclina/CDK; y en donde las dos modificaciones que hay por lo menos antedichas se encuentran dentro de la región correspondiente a los aminoácido.

14. 168 de la KRP1 de Brassica (BnKRP1) , estando cada sustitución de aminoácidos en una posición seleccionada independientemente del grupo que consiste en:

(a) (a) una posición correspondiente al aminoácido 145 de la BnKRP1;

(b) (a) una posición correspondiente al aminoácido 149 de la BnKRP1;

(c) (a) una posición correspondiente al aminoácido 151 de la BnKRP1; 20 (d) (a) una posición correspondiente al aminoácido 153 de la BnKRP1;

(e) (a) una posición correspondiente al aminoácido 164 de la BnKRP1; y

(f) (a) una posición correspondiente al aminoácido 165 de la BnKRP1.

2. El polipéptido CKI mutante de la reivindicación 1, en donde las dos modificaciones que hay por lo menos antedichas se encuentran dentro de la región de unión a la CDK correspondiente a los aminoácido.

14. 168 de la 25 KRP1 de Brassica napus (BnKRPI, SEC ID Nº .: 68) .

3. El polipéptido CKI mutante de la reivindicación 1, en donde el polipéptido CKI mutante no inhibe la actividad quinasa del complejo ciclina/CDK cuando se utiliza en una cantidad 10 veces mayor que la cantidad minima de CKI de tipo salvaje necesaria para abolir la actividad quinasa del complejo ciclina/CDK en un ensayo de la actividad quinasa in vitro.

4. El polipéptido CKI mutante de la reivindicación 1, en donde el polipéptido CKI de plantas de tipo salvaje es de una planta monocotiledónea, una planta dicotiledónea o una planta inferior.

5. El polipéptido CKI mutante de la reivindicación 4, en donde el polipéptido CKI de plantas de tipo salvaje se deriva de la Brassica napus, Arabidopsis thaliana, soja (Glycine max) , maíz, arroz, trigo, alfalfa, algodón y chopo.

6. Un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido CKI mutante de cualquiera de las reivindicaciones 1 35 a 5.

7. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 6.

8. El vector de expresión de la reivindicación 7, en donde el vector de expresión comprende además un promotor unido de manera operativa al ácido nucleico recombinante.

9. El vector de expresión de la reivindicación 8, en donde el promotor es un promotor constitutivo, un promotor

inducible, un promotor específico de los tejidos, un promotor de desarrollo regulado o un promotor específico de las etapas.

10. El vector de expresión de la reivindicación 9, en donde el promotor constitutivo es un promotor CaMV 35S, el promotor específico a los tejidos es un promotor específico a las semillas, o el promotor es un promotor del desarrollo temprano de los embriones o un promotor específico de los embriones.

11. Una planta transgénica, órgano de plantas, semillas, células de plantas o la progenie de las mismas que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 6.

12. La planta transgénica de la reivindicación 11, en donde la planta es espárrago, maíz, cebada, trigo, arroz, sorgo, caña de azúcar, cebolla, mijo, centeno, avena, tomate, tabaco, algodón, canola, carmelina, habas, soja, pimientos, lechuga, chopo, pino, cedro, roble o abeto.

13. Un método para aumentar el vigor de las plantas, la masa radicular, el tamaño de los frutos, el tamaño de las

semilla de plantas, el número de semillas de plantas, el rendimiento de las plantas, biomasa de las plantas, germinación temprana o división celular en unaplanta, que consiste en expresar dentro de la planta el polipéptido CKI mutante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la planta es espárrago, maíz, cebada, trigo, arroz, sorgo, caña de azúcar, cebolla, mijo, centeno, avena, tomate, tabaco, algodón, canola, carmelina, habas, soja, pimientos, lechuga, 10 chopo, pino, cedro, roble o abeto.