Purificación de inmunoglobulinas.

Método para obtener una inmunoglobulina en forma monomérica, en el que el método comprende la etapa siguiente:

aplicar una solución acuosa tamponada que comprende una inmunoglobulina en forma monomérica y en forma agregada y/o fragmentos de inmunoglobulina a un material cromatográfico de intercambio aniónico, en el que la solución acuosa tamponada presenta un valor de pH de entre pH 8,0 y pH 8,5, y en el que la inmunoglobulina empobrecida en agregados de inmunoglobulina y fragmentos de inmunoglobulina se recupera del eluido del material de cromatografía de intercambio aniónico y de esta manera se obtiene una inmunoglobulina en forma monomérica

Purificación de inmunoglobulinas

La presente invención se encuentra en el campo de la purificación de polipéptidos. Se informa de un método para proporcionar una inmunoglobulina en forma monomérica mediante la separación de la inmunoglobulina en solución de las impurezas, especialmente de la inmunoglobulina en forma agregada y de los fragmentos de inmunoglobulina.

Antecedentes de la invención

Las proteínas y especialmente las inmunoglobulinas desempeñan un papel importante en la cartera médica actual. Para la aplicación en el ser humano toda proteína terapéutica debe cumplir unos claros criterios. Para garantizar la seguridad de los agentes biofarmacéuticos para el ser humano, deben eliminarse especialmente los ácidos nucleicos, virus y proteínas de célula huésped, que podrían resultar perjudiciales. Para cumplir las especificaciones legales deben realizarse una o más etapas de purificación después del procedimiento de fermentación. Entre otras cosas, la pureza, la cantidad producida y el rendimiento desempeñan un papel importante en la determinación del procedimiento de purificación apropiado.

Una serie de diferentes métodos se encuentran bien establecidos y son ampliamente utilizados para la purificación de proteínas, tales como la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo la cromatografía de afinidad de proteína A o de proteína G), la cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo de intercambio catiónico (por ejemplo de intercambio catiónico (resinas sulfopropilo o carboximetilo), de intercambio aniónico (resinas aminoetilo) y de intercambio de modo mixto), la adsorción tiofílica (por ejemplo con beta-mercaptoetanol y con otros ligandos de SH), la cromatografía de interacción hidrofóbica o de adsorción aromática (por ejemplo con fenil- sefarosa, resinas aza-arenofílicas o ácido m-aminofenilborónico), la cromatografía de afinidad de quelato metálico (por ejemplo con material de afinidad por el Ni(ll) y por el Cu(ll)), la cromatografía de exclusión por tamaño, y métodos electroforéticos (tales como la electroforesis en gel y la electroforesis capilar) (ver, por ejemplo, Vijayalakshmi M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75:93-12, 1998).

Necina R. et al. (Biotechnol. Bioeng. 6:689-698,1998) han informado de la captura de anticuerpos monoclonales humanos directamente de los sobrenadantes de cultivo celular mediante medios de intercambio iónico que muestran una densidad de carga elevada. En el documento n° WO 89/5157 se informa de un método para la purificación de Inmunoglobulinas de producto sometiendo directamente el medio de cultivo celular a un tratamiento de intercambio catiónico. Se describe una purificación en una etapa de anticuerpos IgG monoclonales a partir de ascites de ratón en Danielsson A. etal., J. Immunol. Meth. 115:79-88, 1988.

Mhatre R. et al., J. Chrom. A 77:225-231, 1995, han explorado la purificación de fragmentos Fab de anticuerpo mediante cromatografía de intercambio catiónico y elución de gradiente de pH. El documento n° WO 94/561 informa de anticuerpos monoclonales anti-rhesus humanos y líneas celulares productoras de los mismos. Un método para purificar un polipéptido mediante cromatografía de intercambio iónico se informa en el documento n° WO 24/24866 en el que se utiliza un lavado en gradiente para resolver un polipéptido de interés de uno o más contaminantes. Schwarz A. et al., Laborpraxis 21:62-66, 1997, informan de la purificación de anticuerpos monoclonales con una columna CM-HyperD. El documento n° WO 24/76485 informa de un procedimiento para la purificación de anticuerpos mediante cromatografía de proteína Ay de intercambio iónico. En la patente EP n° 53 447 se informa de un procedimiento para purificar anticuerpos IgG monoclonales mediante una combinación de tres etapas cromatográficas. La eliminación de la proteína A de las preparaciones de anticuerpos se informa en la patente US n° 4.983.722.

Los procedimientos de anticuerpos monoclonales recombinantes con frecuencia utilizan la cromatografía de intercambio aniónico para unir niveles traza de impurezas y contaminantes potenciales, tales como ADN, proteínas de las células huésped y virus, permitiendo simultáneamente la elución del anticuerpo (Knudsen H.L. et al., J. Chrom. A97:145-154, 21).

El documento n° WO 95/1637 informa de la purificación de anticuerpos monoclonales biespecíficos anti-EGF- R/anti-CD3 de hibridoma híbrido realizada mediante cromatografía de proteína A y de intercambio catiónico. La separación de monómeros de anticuerpo de sus multímeros mediante la utilización de cromatografía de intercambio iónico se informa en la patente EP n° 1 84 136. La patente US n° 5.429.746 se refiere a la aplicación de cromatografía de interacción hidrofóbica de combinación a la purificación de moléculas de proteína anticuerpo. Una membrana microporosa modificada aniónica para la utilización en la filtración de fluidos, en particular líquidos parenterales o biológicos contaminados con partículas cargadas, se informa en la patente US n° 4.64.28. El documento n° WO 3/4166 informa de una membrana y un dispositivo diseñado para la eliminación de impurezas traza en flujos que contienen proteínas.

Se informa de un método para recuperar un polipéptido en la patente US n° 6.716.598. En el documento n° US 26/194953 se Informa de un método para eliminar selectivamente fugas de proteína A respecto de anticuerpos purificados mediante cromatografía de afinidad de proteína A. La separación de proteínas monoméricas respecto de agregados mediante la utilización de cromatografía de intercambio iónico se informa en el documento n° WO 99/62936. Lynch P. y Londo T., Gen. Eng. News 11:17, 1997 informan de un sistema para la eliminación de agregados de anticuerpos de grado terapéutico purificados por afinidad. Se informa de una purificación en dos etapas de un anticuerpo monoclonal murino destinado a la aplicación terapéutica en Jiskoot W. et al., J. Immunol. Meth. 124:143-156, 1989.

En el documento n° WO 99/62936 se informa de la separación de proteínas monoméricas respecto de agregados mediante la utilización de cromatografía de intercambio iónico en modo unión/elución. Se informa de un sistema para la eliminación de agregados de anticuerpos de grado terapéutico purificados por afinidad en Lynch P. et al. (Genetic Engineering News, Mary Ann Libert, New York, página 17, 1997). Jiskoot W. et al. informan de una purificación en dos etapas de un anticuerpo monoclonal murino destinado a la aplicación terapéutica en el hombre, optimización de las condiciones de purificación e incremento progresivo (J. Immunol. Meth. 124:143-156, 1989).

Descripción resumida de la invención

La presente invención comprende aspectos en el campo de la purificación de inmunoglobulinas. Se ha encontrado que una eatpa de cromatografía de intercambio aniónico en la que puede obtenerse la inmunoglobulina en forma monomérica a partir de un material de intercambio aniónico en un modo elución debe llevarse a cabo en un intervalo estrecho de valores de pH, de entre pH 8, y pH 8,5. Inesperadamente, una pequeña desviación respecto de dicho intervalo de valores de pH, por ejemplo a pH 7, ó a pH 9,, anula dicho efecto. Con el método según la invención resulta posible separar en una única etapa la inmunoglobulina en forma monomérica de la Inmunoglobulina en forma agregada y de los fragmentos de inmunoglobulina.

Un aspecto es un método para obtener una inmunoglobulina en forma monomérica, en el que el método comprende la etapa siguiente:

aplicar una solución acuosa tamponada que comprende una inmunoglobulina en forma monomérica y en forma

agregada y/o fragmentos de inmunoglobulina a un material cromatográfico de intercambio aniónico,

en el que la inmunoglobulina eliminada de agregados de inmunoglobulina y de fragmentos de inmunoglobulina se recupera del eluido o del sobrenadante del material de cromatografía de Intercambio aniónico, en el que la solución acuosa tamponada presenta un valor de pH de entre pH 8, y pH 8,5, y de esta manera se obtiene una inmunoglobulina en forma monomérica. En otra realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico es un material de cromatografía de intercambio aniónico de membrana. En una realización adicional, el material de cromatografía de intercambio aniónico es un material de cromatografía de Intercambio aniónico fuerte que presenta un grupo de amonio cuaternario como sustituyente cargado. En otra realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico fuerte es Q-sefarosa®, es decir, una matriz de agarosa entrecruzada (R) al que se unen covalentemente grupos de amonio cuaternario de fórmula R--CH2CHHCH2CH2CHHCH2N+(CH3)3.... [Seguir leyendo]

1. Método para obtener una ¡nmunoglobulina en forma monomérica, en el que el método comprende la etapa siguiente:

aplicar una solución acuosa tamponada que comprende una inmunoglobulina en forma monomérica y en forma

agregada y/o fragmentos de ¡nmunoglobulina a un material cromatográfico de intercambio aniónico, en el que la solución acuosa tamponada presenta un valor de pH de entre pH 8, y pH 8,5, y en el que la inmunoglobulina empobrecida en agregados de inmunoglobulina y fragmentos de inmunoglobulina se recupera del eluido del material de cromatografía de intercambio aniónico y de esta manera se obtiene una inmunoglobulina en 1 forma monomérica.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho material de cromatografía de intercambio aniónico es un material de cromatografía de intercambio aniónico de membrana.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho material de cromatografía de intercambio

aniónico es un material de intercambio aniónico fuerte que presenta un grupo de amonio cuaternario como sustituyente cargado.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho método comprende 2 antes de la etapa a) una etapa adicional de cromatografía de proteína A o una etapa de cromatografía hidrofóbica de inducción de carga.