Procedimiento para preparar conjugados de anticuerpos y de maitansinoides.

Un procedimiento para preparar un conjugado que comprende un anticuerpo químicamente acoplado a un maitansinoide,

comprendiendo dicho procedimiento:

(a) poner en contacto un anticuerpo con un reactivo entrecruzante bifuncional para unir covalentemente un conector al anticuerpo y así preparar una primera mezcla que comprende anticuerpos que tienen conectores estable e inestablemente unidos a los mismos;

(b) someter la primera mezcla a cromatografía no adsortiva para purificar el anticuerpo que tiene conectores unidos al mismo de otros componentes de la primera mezcla y así preparar una primera mezcla purificada;

(c) conjugar un maitansinoide con los anticuerpos que tienen conectores unidos a los mismos por reacción de los anticuerpos que tienen conectores unidos a los mismos con un maitansinoide en una solución que tiene un pH de 4,5 a 8, para preparar una segunda mezcla que comprende (i) anticuerpo químicamente acoplado a través del conector con el maitansinoide, (ii) maitansinoide libre y (iii) solventes y subproductos de la reacción;

(d) someter la segunda mezcla a cromatografía no adsortiva para purificar los anticuerpos químicamente acoplados a través de los conectores con el maitansinoide de los otros componentes de la segunda mezcla y así preparar una segunda mezcla purificada;

(e) opcionalmente, someter la segunda mezcla purificada a filtración de flujo tangencial (TFF) para aislar un conjugado que comprende el anticuerpo químicamente acoplado a el maitansinoide, y

(f) mantener la mezcla entre al menos una de las etapas b-c y de las etapas d-e para liberar los conectores inestablemente unidos del anticuerpo,

donde la etapa de mantenimiento comprende

(i) incubar la mezcla a una temperatura de 2°C a 8°C durante un tiempo de 5 horas a 30 días,

(ii) incubar la mezcla a 25°C a un pH de 6 a 7,5 durante un tiempo de 12 horas a 1 semana,

(iii) incubar la mezcla a entre 20 y 30°C a un pH de 6,5 durante un tiempo de 12 horas a 1 semana,

(iv) incubar la mezcla a 25°C a un pH de 4,5 a 5,9 durante un tiempo de 5 horas a 1 día, o

(v) incubar la mezcla a entre 20 y 30°C a un pH de 5 durante un tiempo de 5 horas a 3 días.

Procedimiento para preparar conjugados de anticuerpos y de maitansinoides Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión a células químicamente acoplado a un fármaco.

Antecedentes de la invención

El tratamiento del cáncer ha progresado significativamente con el desarrollo de productos farmacéuticos que se dirigen y matan a las células cancerosas más eficazmente. Con este fin, los investigadores han aprovechado los receptores y antígenos de la superficie celular expresados de manera selectiva por las células cancerosas para desarrollar fármacos basados en anticuerpos que se unen a los antígenos específicos de tumores o asociados a tumores. En este sentido, se han unido químicamente moléculas citotóxicas, tales como bacterias y toxinas de plantas, radlonúclldos y ciertos fármacos quimioterapéutlcos a anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos de la superficie celular específicos de tumores o asociados a tumores (véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente (PCT) Internacional WO /2587, WO 2/6955 y WO 2/92127, las Patentes de EE. UU. 5.475.92, 6.34.71 y 6.171.586, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. 23/421 A1 yGhetie et al., J. Immunol. Methods, 112, 267-277 (1988)). Se hace típicamente referencia a dichos compuestos como "conjugados" de toxina, radionúclldo y fármaco, respectivamente. Con frecuencia, también se hace referencia a ellos como ¡nmunoconjugados, radiolnmunoconjugados e inmunotoxinas. La muerte de las células tumorales se produce al unirse el conjugado de fármaco a una célula tumoral y activarse la actividad citotóxica del maitansinoide. La selectividad aportada por los conjugados de fármaco minimiza la toxicidad para las células normales, aumentando así la tolerabllldad del fármaco en el paciente.

Se han descrito previamente procedimientos para conjugar anticuerpos con agentes citotóxicos que contienen sulfhidrilo, tales como maitansinoides (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. 5.28.2, 5.416.64 y 6.441.163. Por ejemplo, las Patentes de EE. UU. 5.28.2 y 5.416.64 divulgan un procedimiento para fabricar conjugados de anticuerpo-maitansinoide, donde el anticuerpo es primeramente modificado con un reactivo heterobifuncional, tal como se describe en las Patentes de EE. UU. 4.149.3 y 4.563.34. Las Patentes de EE. UU. 5.28.2 y 5.416.64 describen además la conjugación de un anticuerpo modificado con un exceso de un agente cltotóxico que contiene sulfhidrilo a pH 7, seguida de purificación en columnas de cromatografía SEPHADEX G25. También se ha descrito la purificación de conjugados anticuerpo-fármaco por cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) (véanse, por ejemplo, Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 93, 8618-8623 (1996), y Chari et al., Cáncer Research, 52, 127-131 (1992)).

La Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 3/57163 describe la modificación de un anticuerpo a un pH de 5, a 8,, la eliminación del conector no reaccionado por filtración de flujo tangencial (TFF), la conjugación del anticuerpo a un pH de 6, a 6,5 en dimetilacetamida (DMA) y/o acetonitrilo y la purificación del conjugado por cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, hidroxiapatito cerámico (CHT)). Se eluye el anticuerpo con una mayor concentración de cloruro de sodio. Como alternativa, la Patente de EE. UU. 6.441.163 describe la realización de la conjugación anticuerpo-fármaco en una sola etapa usando un compuesto conector-fármaco preformado.

A pesar de los avances en la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco, los métodos actuales están limitados por varios factores. Por ejemplo, la unión de un agente entrecruzante bifuncional a un anticuerpo es heterogénea en las condiciones actualmente empleadas en la técnica, lo que da lugar a la lenta liberación del fármaco por el conjugado y a inestabilidad del conjugado. Más aún, algunos derivados de conjugados de proteína-disulfuro de 2- piridilo generados con ásteres de hidroxisuccimida son inestables y se descomponen lentamente. Otra limitación es que el propio proceso de conjugación da lugar a la formación de productos de degradación no deseables, tales como especies de alto y bajo peso molecular de conjugado y precipitados, lo que puede dar como resultado menores rendimientos del procedimiento.

Así, en vista de lo anterior, siguen necesitándose métodos mejorados de preparación de composiciones de conjugados de fármacos que sean más estables y de mayor pureza que las composiciones de conjugados de fármacos actualmente disponibles. La invención proporciona dicho método. Éstas y otras ventajas de la invención, así como características inventivas adicionales, resultarán evidentes gracias a la descripción de la invención proporcionada en este documento.

Breve compendio de la invención

La invención proporciona un nuevo procedimiento para preparar un conjugado que comprende un anticuerpo como agente de unión a células químicamente acoplado a un maitansinoide como fármaco. El procedimiento comprende: (a) poner en contacto el agente de unión a células con un reactivo entrecruzante bifuncional para unir covalentemente un conector al agente de unión a células y así preparar una primera mezcla que comprende agentes de unión a células que tienen conectores unidos de manera estable e inestable a estos; (b) someter la primera mezcla a cromatografía no adsortiva para purificar los agentes de unión a células que tienen conectores unidos a sí

mismos de otros componentes de la primera mezcla y así preparar una primera mezcla purificada; (c) conjugar un fármaco con los agentes de unión a células que tienen conectores unidos a sí mismos por reacción de los agentes de unión a células que tienen conectores unidos a sí mismos con el fármaco en una solución que tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8, para preparar una segunda mezcla que comprende (i) un agente de unión a células químicamente acoplado a través del conector con el fármaco, (ii) fármaco libre y (i¡¡) solventes y subproductos de reacción; (d) someter la segunda mezcla a cromatografía no adsortiva para purificar los agentes de unión a células químicamente acoplados a través de los conectores con el fármaco de los otros componentes de la segunda mezcla y así preparar una segunda mezcla purificada; (e) opcionalmente someter la segunda mezcla purificada a filtración de flujo tangencial (TFF) o cromatografía absortiva para aislar un conjugado que comprende el agente de unión a células químicamente acoplado a el fármaco y (f) mantener la mezcla entre al menos una de las etapas b-c y las etapas d-e para liberar los conectores inestablemente unidos del agente de unión a células.

Breve descripción de las diversas vistas del/de los dibujo(s)

La Figura es un gráfico de la liberación del conector ácido 4-(2-piridilditio)pentanoico (PPA) (% del conector total originalmente unido) con respecto a huN91 modificado con 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) después de mantener a varios niveles de pH.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un procedimiento para la preparación de composiciones de conjugados estables que comprenden un anticuerpo como agente de unión a células químicamente acoplado a un maltansinoide como fármaco, donde las composiciones están sustancialmente libres de conjugados inestables. Dichas composiciones pueden ser usadas para tratar enfermedades gracias a la estabilidad y a la gran pureza de los conjugados. Se describen composiciones que comprenden un agente de unión a células, tal como un anticuerpo, químicamente acoplado a un fármaco, tal como un maitansinoide, en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. 24/241174 A1.

Alguien con conocimientos ordinarios en la técnica apreciará que típicamente se preparan conjugados que comprenden un anticuerpo químicamente acoplado a un fármaco ("conjugados anticuerpo-fármaco") purificando un anticuerpo y modificando el anticuerpo purificado, seguido de purificación en una sola etapa, conjugación y una etapa de purificación final. Esta invención mejora dichos métodos incluyendo una etapa de mantenimiento, así como deseablemente diafiltración, conseguida mediante un procedimiento de Filtración de Flujo Tangencial (TFF) basado en membrana, después de la etapa de purificación final. Además, la Invención mejora los métodos previos modificando el pH durante la reacción de conjugación, de tal forma que se optimizan la utilización del fármaco, los rendimientos del procedimiento, la reducción de las reacciones colaterales y la pureza del conjugado agente de unión a células-fármaco. Opclonalmente,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar un conjugado que comprende un anticuerpo químicamente acoplado a un maitansinoide, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) poner en contacto un anticuerpo con un reactivo entrecruzante bifuncional para unir covalentemente un conector al anticuerpo y así preparar una primera mezcla que comprende anticuerpos que tienen conectares estable e inestablemente unidos a los mismos;

(b) someter la primera mezcla a cromatografía no adsortiva para purificar el anticuerpo que tiene conectares unidos al mismo de otros componentes de la primera mezcla y así preparar una primera mezcla purificada;

(c) conjugar un maitansinoide con los anticuerpos que tienen conectares unidos a los mismos por reacción de los anticuerpos que tienen conectares unidos a los mismos con un maitansinoide en una solución que tiene un pH de 4,5 a 8, para preparar una segunda mezcla que comprende (i) anticuerpo químicamente acoplado a través del conector con el maitansinoide, (ii) maitansinoide libre y (iii) solventes y subproductos de la reacción;

(d) someter la segunda mezcla a cromatografía no adsortiva para purificar los anticuerpos químicamente acoplados a través de los conectares con el maitansinoide de los otros componentes de la segunda mezcla y así preparar una segunda mezcla purificada;

(e) opcionalmente, someter la segunda mezcla purificada a filtración de flujo tangencial (TFF) para aislar un conjugado que comprende el anticuerpo químicamente acoplado a el maitansinoide, y

(f) mantener la mezcla entre al menos una de las etapas b-c y de las etapas d-e para liberar los conectores inestablemente unidos del anticuerpo,

donde la etapa de mantenimiento comprende

(i) incubar la mezcla a una temperatura de 2°C a 8°C durante un tiempo de 5 horas a 3 días,

(¡i) incubar la mezcla a 25°C a un pH de 6 a 7,5 durante un tiempo de 12 horas a 1 semana,

(iii) incubar la mezcla a entre 2 y 3°C a un pH de 6,5 durante un tiempo de 12 horas a 1 semana,

(iv) incubar la mezcla a 25°C a un pH de 4,5 a 5,9 durante un tiempo de 5 horas a 1 día, o

(v) incubar la mezcla a entre 2 y 3°C a un pH de 5 durante un tiempo de 5 horas a 3 días.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde se mantiene la mezcla entre las etapas b-c.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, donde se mantiene la mezcla entre las etapas d-e.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, donde el anticuerpo es seleccionado entre el grupo consistente en huN91, huMy9-6, huB4, huC242, trastuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, CNT95, huDS6 y rituximab.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el maitansinoide comprende un grupo tiol.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, donde el maitansinoide es N2-desacetil-N2-(3-mercapto-1- oxopropiljmaitansina (DM1).

9. El procedimiento de la reivindicación 7, donde el maitansinoide es N2-desacetil-N2-(4-metil-4-mercapto-1- oxopentiljmaitansina (DM4).

1. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el anticuerpo está químicamente acoplado a el maitansinoide por enlaces químicos seleccionados entre el grupo consistente en enlaces disulfuro, enlaces lábiles a ácidos, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles a peptidasas, enlaces tioéter y enlaces lábiles a esterasas.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, donde la solución en la etapa (c) y/o (d) comprende además sacarosa.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la solución en la etapa (c) y/o (d) comprende además un agente tamponante seleccionado entre el grupo consistente en un tampón citrato, un tampón acetato, un tampón succinato y un tampón fosfato.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde se liberan los conectores inestablemente

unidos del anticuerpo ajustando el pH de la mezcla de la etapa (f).

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la etapa de mantenimiento comprende la incubación de la mezcla a 4°C y a un pH de 6 a 7,5 durante 12 horas a 4 semanas.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la etapa de mantenimiento comprende la

incubación de la mezcla a 25°C y a un pH de 6 a 7,5 durante 12 horas a 1 semana.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la etapa de mantenimiento comprende la

incubación de la mezcla a 4°C y a un pH de 4,5 a 5,9 durante 5 horas a 5 días.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la etapa de mantenimiento comprende la

incubación de la mezcla a 25°C y a un pH de 4,5 a 5,9 durante 5 horas a 1 día.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde la etapa de mantenimiento comprende

además la adición de un nucleófilo a la mezcla.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, donde el nucleófilo es una amina nucleofílica primaria, una amina nucleofílica secundaria o una combinación de éstas.

2. El procedimiento de la reivindicación 19, donde el nucleófilo es seleccionado entre el grupo consistente en 15 glicilglicina, taurina, dietanolamina, lisina, hidroxilamina, imidazol, etilamina, 4-amino-1-butanol, polilisina, péptidos

portadores de lisina, poli(etilenimina), hidrazina, glicina, etanolamina, 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol y combinaciones de éstos.

21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la cromatografía no adsortiva es seleccionada entre el grupo consistente en resinas SEPHADEX, resinas SEPHACRYL, resinas SUPERDEX y

resinas BIO-GEL®.