Modificación del ARN, que produce unas estabilidad de transcripción y eficiencia de traducción aumentadas.

Molécula de ácido nucleico, que comprende en el sentido 5' →

3' de transcripción:

(a) un promotor,

(b) una secuencia de ácido nucleico transcribible o una secuencia de ácido nucleico para la introducción de una secuencia de ácido nucleico transcribible,

(c) una secuencia de ácido nucleico, que cuando se transcribe bajo el control del promotor (a), codifica una secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos en el transcrito, y

(d) una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa de restricción de tipo IIS,

siendo la distancia entre la secuencia de ácido nucleico (c) y la secuencia de reconocimiento (d) seleccionada, de tal manera que el sitio de escisión de la endonucleasa de restricción de tipo IIS que se une a la secuencia de reconocimiento esté situado dentro de la secuencia de ácido nucleico (c).

Modificación del ARN, que produce unas estabilidad de transcripción y eficiencia de traducción aumentadas.

Las vacunas convencionales, que incluyen los patógenos atenuados o inactivados, son eficaces en muchas áreas, pero no proporcionan una inmunidad protectora eficaz frente a algunos patógenos infecciosos y tumores. Esto hace necesarias vacunas que sean eficaces, versátiles, de producción sencilla y rentable y fáciles de almacenar.

Después de que se hubiera puesto de manifiesto que la inyección intramuscular directa de ADN plasmídico daba lugar a la expresión prolongada de los genes codificados en la superficie celular (Wolff et al, 1990) , las vacunas a base de ADN se consideraron una estrategia nueva y prometedora de inmunización. Esto proporcionó un importante incentivo para el desarrollo de vacunas basadas en ácidos nucleicos. Inicialmente, se ensayaron vacunas a base de ADN contra patógenos infecciosos (Cox et al, 1993; Davis et al, 1993; Ulmer et al, 1993; Wang et al, 1993) , pero pronto se investigaron más detenidamente también como terapia génica contra los tumores con el fin de inducir una inmunidad antitumoral específica (Conr y et al, 1994; Conr y et al, 1995a; Spooner et al, 1995; Wang et al, 1995) . Esta estrategia de inmunización antitumoral tiene diversas ventajas importantes. Las vacunas de ácidos nucleicos son fáciles de preparar y relativamente económicas. Además, se pueden amplificar a partir de un número reducido de células.

El ADN es más estable que el ARN, pero conlleva algunos riesgos potenciales, tales como la inducción de anticuerpos anti-ADN (Gilkeson et al, 1995) y la integración del transgén en el genoma hospedador. Esto puede desactivar genes celulares y provocar una expresión a largo plazo incontrolable de dicho transgén u oncogénesis, y, por consiguiente, habitualmente no es aplicable a los antígenos asociados a tumores con potencial oncogénico, tal como, por ejemplo, erb-B2 (Bargmann et al, 1986) y p53 (Greenblatt et al, 1994) . La utilización de ARN ofrece una alternativa atractiva para evitar estos riesgos potenciales.

Las ventajas de utilizar ARN como una especie de terapia génica reversible incluyen la expresión transitoria y su naturaleza no transformante. El ARN no necesita entrar en el núcleo para ser expresado transgénicamente y, además, no se puede integrar en el genoma hospedador, lo que elimina el riesgo de oncogénesis. Al igual que con el ADN (Condon et al, 1996; Tang et al, 1992) , la inyección de ARN también puede inducir respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales in vivo (Hoerr et al, 2000; Ying et al, 1999) .

La inmunoterapia con ARN transcrito in vitro (IVT-RNA) aplica dos estrategias diferentes que han sido ensayadas con éxito en diversos modelos animales. O bien se inyecta directamente ARN a través de diferentes vías de inmunización (Hoerr et al, 2000) , o se transfectan células dendríticas (CD) con ARN transcrito in vitro por lipofección o electroporación y a continuación se administran (Heiser et al, 2000) . Estudios publicados recientemente demuestran que la inmunización con CD transfectadas con ARN induce linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno in vitro e in vivo (Su et al, 2003; Heiser et al, 2002) . Un factor de importancia central para la inducción óptima de las respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T es, entre otros, la dosis, es decir, la densidad de presentación de antígenos en las CD. Se ha intentado estabilizar el IVT-RNA mediante diversas modificaciones con el fin de alcanzar una expresión prolongada del IVT-RNA transferido, y, de este modo, aumentar la presentación de antígenos en las CD. Un requisito básico para la traducción es la presencia de una secuencia 3’ poli (A) , estando la eficiencia de traducción correlacionada con la longitud de la poli (A) (Preiss y Hentze, 1998) . El casquete 5’ y la secuencia 3’ poli (A) activan sinérgicamente la traducción in vivo (Gallie, 1991) . Las regiones no traducidas (UTR) de los genes de globina son otros elementos conocidos que pueden contribuir a estabilizar el ARN y aumentar la eficiencia de traducción (Malone et al, 1989) .

En la bibliografía se conocen algunos vectores IVT que se utilizan de un modo estandarizado como plantilla para la transcripción in vitro y que se han modificado genéticamente de tal modo que se producen transcritos de ARN. Los protocolos que se describen actualmente en la bibliografía (Conr y et al, 1995b; Teufel et al, 2005; Strong et al, 1997; Carralot et al, 2004; Boczkowski et al, 2000) se basan en un vector plasmídico con la siguiente estructura: un promotor en 5’ de ARN polimerasa que permite la transcripción del ARN, seguido por un gen de interés flanqueado en 3’ y/o en 5’ por regiones no traducidas (UTR) , y un casete de 3’ poliadenilo que contiene 50-70 nucleótidos A. Antes de la transcripción in vitro, el plásmido circular se linealiza aguas abajo con respecto al casete de poliadenilo con enzimas de restricción de tipo II (la secuencia de reconocimiento corresponde al sitio de escisión) . De este modo, el casete de poliadenilo corresponde a la posterior secuencia poli (A) en el transcrito. Como resultado de este procedimiento, algunos nucleótidos permanecen como parte del sitio de escisión enzimática tras la linealización y se extienden o enmascaran la secuencia poli (A) en el extremo 3’. No está claro si este saliente no fisiológico afecta a la cantidad de proteína producida intracelularmente a partir de dicho constructo.

Por consiguiente, el ARN parece particularmente adecuado para aplicaciones clínicas. Sin embargo, la utilización de ARN en terapia génica está muy restringido, especialmente por la limitada vida media del mismo, particularmente en el citoplasma, lo que da lugar a una expresión proteínica reducida.

El objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer ARN con una mayor estabilidad y una mayor eficiencia de traducción, así como medios para la obtención del mismo. Debería ser posible obtener grados elevados de expresión mediante la utilización de dicho ARN en estrategias de terapia génica.

Este objetivo se alcanza, según la presente invención, mediante el objetivo de las reivindicaciones.

La presente invención se refiere a la estabilización de ARN, particularmente ARNm, y a un aumento de la traducción de ARNm. Particularmente, la presente invención se refiere a tres modificaciones de ARN, particularmente de ARN transcrito in vitro, que dan lugar a una mayor estabilidad de transcripción y a una mayor eficiencia de traducción.

Según la presente invención, se ha descubierto que el ARN que tiene una secuencia de poli (A) de extremo abierto se traduce de un modo más eficiente que el ARN que tiene una secuencia de poli (A) con un extremo enmascarado. Se ha puesto de manifiesto que una secuencia de poli (A) larga, particularmente de aproximadamente 120 pb, da lugar a una estabilidad de transcripción de ARN y una eficiencia de traducción óptimas. La invención también ha puesto de manifiesto que una doble región 3’ no traducida (UTR) , particularmente del gen de la globina beta humana, en una molécula de ARN, mejora la eficiencia de traducción de un modo que supera claramente el efecto total que se espera utilizando dos UTR individuales. Según la presente invención, se ha puesto de manifiesto que una combinación de las modificaciones descritas anteriormente tienen un efecto sinérgico sobre la estabilización del ARN y el aumento de la traducción.

Utilizando RT-PCR cuantitativa y variantes de eGFP para medir las cantidades de transcripción y el rendimiento proteínico, la presente invención también ha puesto de manifiesto que las modificaciones de ARN según la presente invención mejoran independientemente la estabilidad del ARN y la eficiencia de traducción en la transfección de células dendríticas (CD) . De este modo, ha sido posible aumentar la densidad de los complejos péptido/CMH específicos de antígeno en las células transfectadas y su capacidad para estimular y expandir los linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de antígeno. Por consiguiente, la presente invención se refiere a una estrategia para la optimización de vacunas de CD transfectadas con ARN utilizando ARN modificado mediante las modificaciones de ARN descritas en la presente invención.

Preferentemente, la modificación del ARN según la invención, y con ello la estabilización y/o aumento de la eficiencia de traducción del mismo, se alcanza mediante la modificación genética de vectores de expresión que actúan preferentemente como plantilla para la transcripción de ARN in vitro.

Los vectores de este tipo están destinados a permitir particularmente... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ácido nucleico, que comprende en el sentido 5’ - 3’ de transcripción:

(a) un promotor,

(b) una secuencia de ácido nucleico transcribible o una secuencia de ácido nucleico para la introducción de una secuencia de ácido nucleico transcribible,

(c) una secuencia de ácido nucleico, que cuando se transcribe bajo el control del promotor (a) , codifica una secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos en el transcrito, y

(d) una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa de restricción de tipo IIS,

siendo la distancia entre la secuencia de ácido nucleico (c) y la secuencia de reconocimiento (d) seleccionada, de tal manera que el sitio de escisión de la endonucleasa de restricción de tipo IIS que se une a la secuencia de reconocimiento esté situado dentro de la secuencia de ácido nucleico (c) .

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que las secuencias de ácido nucleico (b) y (c) bajo el control del promotor (a) son transcribibles en un transcrito común y en el transcrito común, la secuencia de ácido nucleico transcrita a partir de la secuencia de ácido nucleico (c) es activa para aumentar la eficacia de la traducción y/o la estabilidad de la secuencia de ácido nucleico transcrita a partir de la secuencia de ácido nucleico transcribible (b) .

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 o 2, en la que la secuencia de ácido nucleico (c) , cuando se transcribe bajo el control del promotor (a) , codifica una secuencia de nucleótidos de por lo menos 40, por lo menos 80, por lo menos 100, preferentemente de manera aproximada 120 nucleótidos A consecutivos en el transcrito.

4. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula de ácido nucleico, tras la escisión en el extremo de la cadena, que sirve como plantilla para la secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos, tiene un nucleótido T, que es parte de la secuencia de nucleótidos, que sirve como plantilla para la secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos en el transcrito.

5. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque es una molécula circular cerrada antes de la escisión y una molécula lineal después de la escisión.

6. Molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción de tipo IIS está situada a una distancia de 5-26, preferentemente d.

2. 26 pares de bases aguas abajo con respecto al extremo 3’ de la secuencia de ácido nucleico (c) .

7. Molécula de ácido nucleico, que se puede obtener por linealización de la molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Procedimiento de transcripción in vitro de una molécula de ARN seleccionada con el fin de aumentar su estabilidad y/o eficiencia de traducción, que comprende:

(i) acoplar una secuencia de ácido nucleico (b) , que cuando se transcribe, codifica una secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos, en el extremo 3’ de una secuencia de ácido nucleico (a) que es transcribible en la molécula de ARN, y (ii) transcribir in vitro los ácidos nucleicos obtenidos,

caracterizado porque el procedimiento comprende, antes de la transcripción del ácido nucleico obtenido, una escisión dentro de la secuencia de ácido nucleico (b) , de manera que con la transcripción del ácido nucleico obtenido de este modo se genera un transcrito, que presenta las secuencias de ácido nucleico transcritas a partir de la secuencia de ácido nucleico (a) y en su extremo 3’, presenta una secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos, presentando el transcrito a modo de nucleótido 3’-terminal un nucleótido A de la secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos y produciéndose la escisión con la ayuda de un sitio de escisión de restricción para una endonucleasa de restricción del tipo IIS.

9. Procedimiento de traducción de una molécula de ARNm seleccionada, con el fin de aumentar su expresión, que comprende:

(i) acoplar una secuencia de ácido nucleico (b) , que cuando se transcribe, codifica una secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos, en el extremo 3’ de una secuencia de ácido nucleico (a) que es transcribible en la molécula de ARNm, y

(ii) traducir el ARNm, que puede ser obtenido por transcripción, preferentemente por transcripción in vitro del

ácido nucleico obtenido,

caracterizado porque el procedimiento comprende, antes de la transcripción del ácido nucleico obtenido, una escisión dentro de la secuencia de ácido nucleico (b) , de manera que con la transcripción del ácido nucleico obtenido de este modo se genera un transcrito, que presenta las secuencias de ácido nucleico transcritas a partir de la secuencia de ácido nucleico (a) y en su extremo 3’, presenta una secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos, presentando el transcrito a modo de nucleótido 3’-terminal un nucleótido A de la secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos y produciéndose la escisión con la ayuda de un sitio de escisión de restricción para una endonucleasa de restricción de tipo IIS.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 o 9, en el que la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción de tipo IIS está situada a una distancia de 5-26, preferentemente d.

2. 26 pares de bases aguas abajo con respecto al extremo 3’ de la secuencia de ácido nucleico, que cuando se transcribe codifica una secuencia de nucleótidos de por lo menos 20 nucleótidos A consecutivos.