PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE CÉLULAS PLURIPOTENTES INDUCIDAS (iPS), LAS CÉLULAS iPS OBTENIDAS Y USOS DE LAS MISMAS.

Procedimiento de obtención de células pluripotentes inducidas (iPS),

las células iPS obtenidas y usos de las mismas.

La presente invención describe un procedimiento de obtención de células troncales pluripotentes inducidas (iPS) mediante la reprogramación celular de células somáticas con vectores de expresión capaces de expresar la región adenoviral E1. Además la presente invención describe tanto las células iPS obtenidas mediante dicho procedimiento, así como el uso de las mismas en el estudio de genes implicados en desarrollo y envejecimiento, en las vías de señalización implicadas en dichos procesos celulares y en estudios de diferenciación de las células iPS a diversos linajes celulares. Las células iPS de la invención también pueden ser usadas en medicina regenerativa, terapia celular y tisular, vehiculización de fármacos o cualquier otra sustancia, o para el tratamiento de patologías de tipo genético como por ejemplo, cáncer, diabetes, ataxia, etc.

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE CÉLULAS PLURIPOTENTES INDUCIDAS (iPS), LAS CÉLULAS iPS

OBTENIDAS Y USOS DE LAS MISMAS.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se adscribe al campo de la biotecnología y la medicina regenerativa y en concreto se refiere a un procedimiento para la obtención de células pluripotentes inducidas (iPS) generadas a partir de la reprogramación celular de células somáticas con vectores de expresión que portan el gen de la región E1 o un fragmento del mismo y/o cualquiera de sus variantes. Además la presente invención también se refiere al uso de las células iPS, así producidas, en medicina regenerativa, terapia celular y tisular, vehiculización de fármacos y tratamiento de patologías de tipo genético, entre otras aplicaciones.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La capacidad de las células troncales embrionarias (ESC en sus siglas en inglés: Embrionary Stem Cells) para dar lugar a todo tipo de células somáticas, junto con su capacidad de crecer indefinidamente en cultivo, pone de relieve su potencial en el tratamiento in vivo de diferentes patologías. Sin embargo, hasta la fecha existen muchos inconvenientes técnicos, así como problemas éticos, para la utilización de dichas ESCs en terapia. Por ejemplo, las ESCs no son genéticamente idénticas entre el organismo del que se obtienen y el organismo al que se transfieren, y por lo tanto, pueden dar lugar a complicaciones del tipo de rechazo e inmunogenicidad que limitaría su uso en trasplantes clínicos o en el tratamiento de otras patologías como pueden ser la diabetes, ataxia, cáncer, etc. Además, de los problemas de rechazo e inmunogenicidad, existen los problemas éticos respecto a la obtención de ESCs humanas a partir de embriones humanos. Por estas razones, se ha venido haciendo un esfuerzo considerable en tratar de obtener células troncales pluripotentes a partir del tejidos postnatales. Sin embargo, la generación de ESC autólogas específicas para cada paciente es técnicamente tedioso y se complica aún más también por las cuestiones éticas anteriormente comentadas, limitando así de manera significativa su potencial para ser usadas en trasplantes o en el tratamiento de diferentes patologías.

El grupo de investigación del Dr. Yamanaka, en el año 2006 consiguió por primera vez la reprogramación celular de fibroblastos murinos embrionarios (MEFs) y fibroblastos adultos de ratón a un estado similar al de las ESCs, mediante la introducción vía retrovirus individuales para cada uno de los factores, en dichas células fibroblásticas, de cuatro factores transcripcionales: Klf4, Sox2, Oct3/4 y c-Myc (1). Dichas células fueron denominadas células troncales pluripotentes inducidas (iPS) y eran similares a las ESCs, ya que compartían con éstas su similitud morfológica, proliferativa, así como la capacidad de generar teratomas. En estudios posteriores, el mismo grupo de investigación demostró que también el factor Nanog, era necesario para generar iPS de línea germinal (2). Por otra parte, el grupo de investigación del Dr. James A. Thomson observó que el factor de transcripción Klf4 no era un factor esencial para lograr la reprogramación de células somáticas hasta convertirlas en células de tipo iPS, ya que sustituyendo dicho factor Klf4 y el factor oncogénico c-Myc, por los factores LIN28 y Nanog (3), fue capaz de obtener células iPS.

Las células iPS, obtenidas mediante los procedimientos descritos en el estado de la técnica, ofrecen un modelo in vitro válido tanto para el estudio de los mecanismos moleculares de la reprogramación celular, como para su empleo en terapia. Sin embargo, hasta la fecha la obtención de células iPS ha requerido, como se ha indicado previamente, de múltiples vectores virales individuales para obtener el total de factores de transcripción necesarios para la inducción de la reprogramación celular (por lo general Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc). Además, es necesario que cada uno de los vectores virales que portan los cuatro factores transcripcionales se expresen simultáneamente en las células diana para convertirse en células iPS y puedan, posteriormente, dar lugar a una descendencia celular reprogramada con capacidad pluripotente.

Es conveniente mencionar en este sentido que, parte de los factores transcripcionales utilizados en el estado de la técnica para generar células iPS codifican para genes oncogénicos, como por ejemplo, el factor transcripcional c-Myc, haciendo que dichas iPS no sean seguras, como se ha comentado anteriormente. Además, muchas de las células que se infectarán con los virus que portan los factores de transcripción necesarios para obtener las células iPS descritas hasta el momento en el estado de la técnica, integrarán en su genoma sólo uno, dos o tres de dichos factores, lo que dificulta la obtención de una población homogénea de células reprogramadas iPS así como el estudio de las mismas.

Con todos los inconvenientes mencionados, existe una necesitad en el estado de la técnica de desarrollar nuevos procedimientos de obtención de células iPS que, sean más eficientes y con una mínima o nula integración viral en el genoma de las células iPS obtenidas, lo que las haría más seguras, además de eliminar genes que pudieran causar efectos dañinos, tales como el factor c-Myc, por ejemplo, al ser un gen pro- oncogénico.

Una de las posibilidades para resolver dichos problemas o inconvenientes, podría ser, por un lado, la disminución del número de factores de transcripción necesarios para obtener células iPS y, por otro lado, como se ha comentado previamente, la eliminación de factores pro-oncogénlcos como puede ser el factor c-Myc, obteniendo células ¡PS más seguras. En este sentido, la presente Invención describe un nuevo procedimiento de obtención de células ¡PS mediante la reprogramación celular de células somáticas con vectores de expresión que portan en su genoma el locus o reglón E1 de adenovirus, o un fragmento de la misma o variantes de la misma, preferentemente de adenovirus 5. Dicha región E1 de adenovirus 5 contiene las secuencias génicas que codifican y expresan para los genes E1A y/o E1B, así como para cualquiera de sus posibles variantes.

La región E1 de adenovirus, preferentemente del adenovirus 5 (n° acceso NCBI: AC_000008.1), es una unidad transcripcional de expresión temprana que codifica, como hemos mencionado previamente, para dos proteínas, E1A (n° acceso NCBI: AP_000197.1) y E1B (n° acceso NCBI: AP_000198.1 y AP_000199.1). El gen E1A de adenovirus 5 se ha descrito como un gen supresor de tumores (2-4), incluso, hay gran diversidad de ensayos denominados de viroterapia oncolítica que proponen el uso de dichos genes y de las proteínas que codifican, como una estrategia viable (5-8), sola o combinada con radioterapia o quimioterapia, debido a su efecto sensibilizador a los tratamientos frente al cáncer (9).

La expresión del gen que codifica para la proteína E1A requiere únicamente de las proteínas de la célula hospedadora y dicha expresión se facilita gracias a la presencia de una región potenciadora situada antes del promotor de la reglón E1A. Sin embargo, y aunque la proteína E1A es capaz de activar su propio promotor, también es capaz de reconocer la secuencia potenciadora e Inhibir su función, por lo que cuando se produce un Incremento en los niveles de expresión de la proteína E1A, hay una regulación negativa de la misma. El gen adenovlral E1A codifica para 5 ARNm diferentes: 9S, 10S, 11S 12S y 13S. Sólo las regiones 12S y 13S regulan la transcripción de genes virales y celulares en las células Infectadas. Las proteínas codificadas por las regiones 12S y 13S difieren exclusivamente en un fragmento de 46 aminoácidos. En este sentido, el análisis de expresión del ARNm de dichas regiones, muestra que los transcritos más expresados son los que corresponden a la proteína E1A-12S (N° de acceso a GenBank: AY368049.1) y a la E1A-13S (N° de acceso a GenBank: AAQ72377.1), aunque existen otras variantes (11S, 10S y 9S) como consecuencia de procesos alternativos de ensamblaje (splicing, en inglés). Las dos proteínas más expresadas, E1A-12S (N° de acceso a GenBank: AY368049.1) y E1A-13S (N° de acceso a GenBank: AAQ72377.1), actúan como reguladores transcripcionales de otros genes de expresión temprana y, como moduladores de la expresión de los genes de la célula hospedadora, afectando al ciclo celular de dicha célula hospedadora y favoreciendo el proceso de replicación viral.

Así, en la presente invención, se describe el uso de la región o locus E1 de adenovirus (N° acceso GenBank: X02996.1), o un fragmento del mismo o cualquiera de sus variantes, preferentemente de adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12, para la reprogramación de células... [Seguir leyendo]

1. Células plurlpotentes inducidas (¡PS) caracterizadas por que codifican y expresan al menos uno de los genes adenovirales comprendidos en la secuencia génica de la región adenoviral E1 o cualquiera de sus variantes.

2. Células iPS según la reivindicación 1 caracterizadas por que la región adenoviral E1 o cualquiera de sus variantes, son procedentes de adenovirus, seleccionados entre: adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12.

3. Células iPS según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 caracterizadas por que los genes adenovirales comprendidos en la región E1 o cualquiera de sus variantes, se seleccionan entre: E1A y/o cualquiera de sus variantes.

4. Células iPS según la reivindicación 3 caracterizadas por que codifican y expresan el gen E1 A.

5. Células iPS según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 caracterizadas por que son células de mamífero.

6. Células iPS según la reivindicación 5 caracterizadas por que son células humanas.

7. Plásmido caracterizado por que comprende la secuencia génica adenoviral E1 o cualquiera de sus variantes.

8. Plásmido según la reivindicación 7 caracterizado por que la secuencia génica adenoviral E1, o cualquiera de sus variantes, son procedentes de adenovirus, seleccionados entre: adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12.

9. Plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 caracterizado por que la secuencia génica de la región E1o cualquiera de sus variantes, codifica y expresa para al menos uno de los genes seleccionados entre: E1A y/o cualquiera de sus variantes.

10. Plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 7-9 caracterizado por que comprende la secuencia génica que codifica y expresa el gen E1A.

11. Vector de expresión que comprende al menos un plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 7- 10.

12. Vector de expresión según la reivindicación 11 caracterizado por que consiste en un vector viral seleccionado de entre: adenovirus, lentivirus, retrovirus y adenoasociados.

13. Vector de expresión según la reivindicación 11 caracterizado por que consiste en un vector no viral seleccionado de entre: liposomas, nanopartfculas, PEI y/o fosfato cálcico.

14. Composición que comprende las células pluripotentes inducidas (iPS) de las reivindicaciones 1-6.

15. Composición según la reivindicación 14 caracterizada por que es una composición farmacéutica.

16. Composición según la reivindicación 15 caracterizada por que además comprende al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

17. Uso de la región adenoviral E1, o cualquiera de sus variantes, para la reprogramación celular//? vitro de células somáticas.

18. Uso según la reivindicación 17 caracterizado por que la región adenoviral E1, o cualquiera de sus variantes, procede de adenovirus seleccionados entre: adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17-18 caracterizado por que la región adenoviral E1, o cualquiera de sus variantes, codifica y expresa al menos un gen adenoviral seleccionado entre: E1A y/o cualquiera de sus variantes.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17-19 caracterizado por que la región adenoviral E1, o cualquiera de sus variantes, codifica y expresa el gen adenoviral E1 A.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17-20 caracterizado porque las células somáticas son células de mamífero.

22. Uso según la reivindicación 21 caracterizado por que las células de mamífero son células humanas.

23. Uso de la región adenoviral E1, o cualquiera de sus variantes, para la obtención in vitro de células pluripotentes inducidas (iPS).

24. Uso según la reivindicación 23 caracterizado por que la región adenoviral E1, o cualquiera de sus variantes, procede de adenovirus seleccionados entre: adenovirus 2, adenovirus 5 o adenovirus 12.

25. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23-24 caracterizado por que la región adenoviral E1, o cualquiera de sus variantes, codifica y expresa al menos un gen adenoviral seleccionado entre: E1A y/o cualquiera de sus variantes.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 23-25 caracterizado por que la región adenoviral E1, o cualquiera de sus variantes, codifica y expresa el gen adenoviral E1 A.

27. Uso del vector de expresión de las reivindicaciones 11-13 o del plásmido de las reivindicaciones 7-10 para la reprogramación celular in vitro.

28. Uso del vector de expresión de las reivindicaciones 11-13 o del plásmido de las reivindicaciones 7-10 para la producción in vitro de células pluripotentes inducidas (iPS).

29. Uso de las células pluripotentes inducidas (iPS) de las reivindicaciones 1-6 en la elaboración de un medicamento.

30. Uso de las células pluripotentes inducidas (iPS) de las reivindicaciones 1-6 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de entre: patologías inmunitarias, inflamatorias, genéticas, cáncer, diabetes, ataxia, medicina regenerativa y en terapia celular y/o tisular.

31. Procedimiento de producción de células pluripotentes inducidas (iPS) a partir de células somáticas que comprende la introducción en dichas células somáticas de un vector de expresión según se define en cualquiera de las reivindicaciones 11-13.

32. Procedimiento según la reivindicación 31 caracterizado por que las células somáticas son células de mamífero.

33. Procedimiento según la reivindicación 32 caracterizado por que las células de mamífero son células humanas.

34. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31-33 que además comprende cultivar las células en las que se ha introducido un vector de expresión según se define en cualquiera de las reivindicaciones 11-13, bajo condiciones que permitan la producción de una población de células pluripotentes inducidas (iPS).

35. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 31-34 caracterizado por que comprende, además, el aislamiento de la población de iPS obtenidas.