Delta-5 desaturasa y su uso para fabricar ácidos grasos poliinsaturados.

Un polinucleótido aislado, que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad delta-5 desaturasa,

en el que el polipéptido tiene al menos 90% de identidad de aminoácidos, basada en el método de alineamiento Clustal W, cuando se compara con una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2;

(b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que la secuencia de nucleótidos tiene al menos 90% de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento BLASTN, cuando se compara con una secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; o

(c) un complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b), en el que el complemento y la secuencia de nucleótidos están formados por el mismo número de nucleótidos y son 100% complementarios.

Delta-5 desaturasa y su uso para fabricar ïcidos grasos poliinsaturados Campo de la invenciïn La presente invenciïn pertenece al campo de la biotecnologïa. De modo mïs especïfico, esta invenciïn se refiere a 5 la identificaciïn de fragmentos de ïcidos nucleicos que codifican una enzima delta-5 ïcido graso desaturasa y al uso de esta desaturasa para fabricar ïcidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA) .

Antecedentes de la invenciïn La importancia de los PUFA es indiscutible. Por ejemplo, ciertos PUFA son importantes componentes biolïgicos de las cïlulas sanas y son reconocidos como ïcidos grasos “esenciales” que no pueden ser sintetizados de novo en 10 mamïferos, sino que deben obtenerse de la dieta o derivarse por la posterior desaturaciïn y alargamiento del ïcido linoleico (LA; 18:2 omega-6) o del ïcido alfa-linolïnico (ALA; 18:3 omega-3) ; son constituyentes de las membranas plasmïticas de las cïlulas, en las que pueden econtrarse en formas tales como fosfolïpidos o triacilgliceroles; son necesarios para el desarrollo correcto (en particular, en el cerebro de los niïos en desarrollo) y para la formaciïn y reparaciïn de los tejidos; y son precursores para varios eicosanoides biolïgicamente activos de importancia en 15 mamïferos (por ejemplo, prostaciclinas, eicosanoides, leucotrienos, prostaglandinas) . Ademïs, una alta ingesta de PUFA omega-3 de cadena larga produce efectos protectores cardiosvasculares (Dyerberg, J. et al., Amer. J. Chin. Nutr., 28:958-966 (1975) ; Dyerberg, J. et al., Lancet, 2 (8081) :117-119 (15 de julio, 1978) ; Shimokawa, H., World Rev. Nutr. Diet, 88:100-108 (2001) ; von Schacky, C. y Dyerberg, J., World Rev. Nutr. Diet, 88:90-99 (2001) ) . Ademïs, numerosos estudios diferentes documentan beneficios para la salud muy diversos conferidos por la administraciïn de PUFA omega-3 y/u omega-6 contra una diversidad de sïntomas y enfermedades (por ejemplo, asma, psoriasis, eccema, diabetes, cïncer) .

Se estïn investigando una diversidad de diferentes hospedantes, que incluyen plantas, algas, hongos y levaduras, como medio para la producciïn comercial de PUFA. La ingenierïa genïtica ha demostrado que las capacidades naturales de algunos hospedantes (incluso los que estïn limitados nativamente a la producciïn de ïcidos grasos LA

y ALA) pueden ser sustancialmente alteradas para conseguir una producciïn de alto nivel de diversos PUFA omega3/omega-6 de cadena larga. Tanto si esto es el resultado de las capacidades naturales como de la tecnologïa recombinante, la producciïn de ïcido araquidïnico (ARA; 20:4 omega-6) , ïcido eicosapentaenoico (EPA; 20:5 omega-3) y ïcido docosahexaenoico (DHA; 22:6 omega-3) puede requerir la expresiïn de una delta-5 desaturasa.

La mayorïa de las enzimas delta-5 desaturasa identificadas hasta la fecha tienen la capacidad principal de convertir

el ïcido dihomo-gamma-linolïnico (DGLA; 20:3 omega-6) en ARA, con una actividad secundaria para convertir el ïcido eicosatetraenoico (ETA; 20:4 omega-3) en EPA (siendo el DHA posteriormente sintetizado a partir de EPA despuïs de una reacciïn con otra C20/22 elongasa y una delta-4 desaturasa) . La delta-5 desaturasa desempeïa un papel en la vïa de la delta-6 desaturasa/delta-6 elongasa (que se encuentra predominantemente en algas, musgos, hongos, nemïtodos y seres humanos, y que se caracteriza por la producciïn de ïcido gamma-linolïnico (GLA; 18:3

omega-6) y/o ïcido estearidïnico (STA; 18:4 omega-3) ) y la vïa de delta-9 elongasa/delta-8 desaturasa (que actïa en algunos organismos, tales como especies euglenoides, y que se caracteriza por la producciïn de ïcido eicosadienoico (EDA; 20:2 omega-6) y/o ïcido eicosatrienoico (ETrA; 20:30 omega-3) ) (figura 1) .

Basïndose en el papel que desempeïan las enzimas delta-5 desaturasas en la sïntesis, por ejemplo, de ARA, EPA y DHA, se ha realizado un consiferable esfuerzo para identificar y caracterizar estas enzimas a partir de diversas 40 fuentes. Como tales, se han describo numerosas delta-5 desaturasas en la bibliografïa pïblica (por ejemplo, n.ï de registro de GenBank AF199596, AF226273, AF320509, AB072976, AF489588, AJ510244, AF419297, AF07879, AF067654 y AB022097) y la bibliografïa de patentes (por ejemplo, patentes de EEUU 5.972.664 y 6.075.183) . Ademïs, la solicitud provisional en tramitaciïn junto con la presente de propiedad de los solicitantes n.ï 60/801119 (presentada el 17 de mayo, 2006) describe secuencias de aminoïcidos y de ïcidos nucleicos para una enzima delta

5 desaturasa de Peridium sp. CCMP626, mientras que la solicitud provisional en tramitaciïn junto con la presente de propiedad de los solicitantes n.ï 60/915733 (BB1614) (presentada el 3 de mayo, 2007) describe secuencias de aminoïcidos y de ïcidos nucleicos para una enzima delta-5 desaturasa de Euglena anabaena.

Abbadi et al. (The Plant Cell, vol. 16, 2734-2748) describen la expresiïn en plantas transgïnicas de !6 y !5 desaturasas y una !6 elongasa.

La presente invenciïn se refiere a la identificaciïn y el aislamiento de otros genes que codifican delta-5 desaturasas de Euglena gracilis que serïan adecuados para la expresiïn heterïloga en una diversidad de organismos hospedantes para su uso en la producciïn de ïcidos grasos omega-3/omega-6.

Sumario de la invenciïn La presente invenciïn se refiere a un polinucleïtido aislado, que comprende:

(a) una secuencia de nucleïtidos que codifica un polipïptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que el

polipïptido tiene al menos 90%, 95% o 100% de identidad de aminoïcidos, basada en el mïtodo de alineamiento Clustal W, cuando se compara con una secuencia de aminoïcidos indicada en SEQ ID NO:2;

(b) una secuencia de nucleïtidos que codifica un polipïptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que la secuencia de nucleïtidos tiene al menos 90%, 95% o 100% de identidad de secuencia, basada en el mïtodo de alineamiento BLASTN, cuando se compara con una secuencia de nucleïtidos indicada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3;

(c) un complemento de la secuencia de nucleïtidos de (a) o (b) , en el que el complemento y la secuencia de nucleïtidos estïn formados por el mismo nïmero de nucleïtidos y son 100% complementarios.

En una segunda realizaciïn, la invenciïn se refiere a un gen quimïrico que comprende cualquiera de los polinucleïtidos de la invenciïn aislados unidos operablemente al menos a una secuencia reguladora.

En una tercera realizaciïn, la invenciïn se refiere a una cïlula que comprende, en su genoma, el gen quimïrico de la invenciïn. Estas cïlulas pueden ser cïlulas vegetales o cïlulas de levadura.

En una cuarta realizaciïn, la invenciïn se refiere a un mïtodo para transformar una cïlula, que comprende transformar una cïlula con un gen quimïrico de la invenciïn o un polinucleïtido de la invenciïn aislado, y seleccionar las cïlulas transformadas con el gen quimïrico o el polinucleïtido aislado.

En una quinta realizaciïn, la invenciïn se refiere a una semilla transgïnica que comprende, en su genoma, el gen quimïrico de la invenciïn o una semilla transgïnica obtenida a partir de una planta fabricada mediante un mïtodo de la invenciïn. En la presente se describen aceites o subproductos obtenidos a partir de dichas semillas transgïnicas.

En una sexta realizaciïn, la invenciïn se refiere a un mïtodo para fabricar ïcidos grasos poliinsaturados de cadena larga en una cïlula, que comprende:

(a) transformar una cïlula con el gen quimïrico de la invenciïn; y

(b) seleccionar las cïlulas transformadas que fabrican ïcidos grasos poliinsaturados de cadena larga.

En una sïptima realizaciïn, la invenciïn se refierea a un mïtodo para producir al menos un ïcido graso poliinsaturado en una cïlula de una planta de semillas oleaginosas, que comprende:

(a) transformar una cïlula de una planta de semillas oleaginosas con un gen quimïrico de la invenciïn y al menos una construcciïn de ADN recombinante adicional que comprende un polinucleïtido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polipïptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa;

(b) regenerar una planta de semillas oleaginosas a partir de la cïlula transformada de la etapa (a) ; y

(c) seleccionar las semillas obtenidas a partir de las plantas de la etapa (b) que tienen un nivel alterado... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleïtido aislado, que comprende:

(a) una secuencia de nucleïtidos que codifica un polipïptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que el polipïptido tiene al menos 90% de identidad de aminoïcidos, basada en el mïtodo de alineamiento Clustal W, cuando se compara con una secuencia de aminoïcidos indicada en SEQ ID NO:2;

(b) una secuencia de nucleïtidos que codifica un polipïptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que la secuencia de nucleïtidos tiene al menos 90% de identidad de secuencia, basada en el mïtodo de alineamiento BLASTN, cuando se compara con una secuencia de nucleïtidos indicada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; o

(c) un complemento de la secuencia de nucleïtidos de (a) o (b) , en el que el complemento y la secuencia de nucleïtidos estïn formados por el mismo nïmero de nucleïtidos y son 100% complementarios.

2. El polinucleïtido de la reivindicaciïn 1, en el que la secuencia de nucleïtidos:

(a) consiste en SEQ ID NO: o SEQ ID NO:3;

(b) codifica un polipïptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:2; o

(c) codifica una delta-5 desaturasa, segïn se indica en SEQ ID NO:2, en el que dicha secuencia tiene los codones

optimizados para la expresiïn en Yarrowia sp. 3. Un polipïptido que tiene actividad delta-5 desaturasa, en el que el polipïptido tiene al menos 90% de identidad de aminoïcidos, basada en el mïtodo de alineamiento Clustal W, cuando se compara con una secuencia de aminoïcidos indicada en SEQ ID NO:2.

4. Un gen quimïrico que comprende el polinucleïtido de la reivindicaciïn 1 o 2, unido operablemente al menos a una secuencia reguladora.

5. Una cïlula que comprende, en su genoma, el gen quimïrico de la reivindicaciïn 4. 6. La cïlula de la reivindicaciïn 5, en la que dicha cïlula se selecciona del grupo que consiste en plantas y levaduras.

7. Un mïtodo para transformar una cïlula, que comprende transformar una cïlula con el gen quimïrico de la

reivindicaciïn 4, y seleccionar las cïlulas transformadas con el gen quimïrico de la reivindicaciïn 4. 8. El mïtodo de la reivindicaciïn 7, en el que dicha cïlula es una cïlula vegetal, y dicho mïtodo comprende ademïs la etapa de regenerar una planta a partir de la cïlula vegetal transformada.

9. El mïtodo de la reivindicaciïn 8, en el que la planta es una planta de soja. 10. Un mïtodo para fabricar ïcidos grasos poliinsaturados de cadena larga en una cïlula vegetal, que comprende:

(a) transformar una cïlula vegetal con el gen quimïrico de la reivindicaciïn 4;

(b) seleccionar las cïlulas transformadas que fabrican los ïcidos grasos poliinsaturados de cadena larga.

11. Un mïtodo para producir al menos un ïcido graso poliinsaturado en una cïlula de una planta de semillas oleaginosas, que comprende:

(a) transformar una cïlula de una planta de semillas oleaginosas con un gen quimïrico de la reivindicaciïn 4 y al menos una construcciïn de ADN recombinante adicional que comprende un polinucleïtido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polipïptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa;

(b) regenerar una planta de semillas oleaginosas a partir de la cïlula transformada de la etapa (a) ; y

(c) seleccionar las semillas obtenidas a partir de las plantas de la etapa (b) que tienen un nivel alterado de ïcidos grados poliinsaturados, cuando se compara con el nivel en semillas obtenidas a partir de una planta de semillas oleaginosas no transformada.

12. El mïtodo de la reivindicaciïn 11, en el que la planta de semillas oleaginosas se selecciona del grupo que consiste en soja, especies de Brassica, girasol, maïz, algodïn, lino y cïrtamo.

13. El mïtodo de una cualquiera de las reivindicaiones 10 a 12, que comprende ademïs la etapa de extraer dicho ïcido graso poliinsaturado.

14. Una planta transgïnica que comprende, en su genoma, el gen quimïrico de la reivindicaciïn 4.

15. La planta transgïnica de la reivindicaciïn 14, que es una planta de semillas oleaginosas.

16. La planta de semillas oleaginosas de la reivindicaciïn 15, que comprende ademïs una construcciïn de ADN

recombinante adicional que comprende un polinucleïtido aislado unido operablemente al menos a una secuencia reguladora, que codifica un polipïptido seleccionado del grupo que consiste en una delta-4 desaturasa, una delta-5 desaturasa, una delta-6 desaturasa, una delta-8 desaturasa, una delta-12 desaturasa, una delta-15 desaturasa, una delta-17 desaturasa, una delta-9 desaturasa, una delta-9 elongasa, una C14/16 elongasa, una C16/18 elongasa, una C18/20 elongasa y una C20/22 elongasa.

17. La planta de semillas oleaginosas de la reivindicaciïn 15 o 16, que se selecciona del grupo que consiste en soja, especies de Brassica, girasol, maïz, algodïn, lino y cïrtamo.

18. Una semilla transgïnica, que:

(a) comprende, en su genoma, el gen quimïrico de la reivindicaciïn 4;

(b) se obtiene a partir de la planta fabricada por el mïtodo de la reivindicaciïn 8 o 9, y comprende el polinucleïtido 15 de la reivindicaciïn 1 o 2; o (c) se obtiene a partir de la planta de semillas oleaginosas de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, o a partir de la planta de semillas oleaginosas obtenida a partir del mïtodo de la reivindicaciïn 11 o 12, y comprende el polinucleïtido de la reivindicaciïn 1 o 2.

19. Un alimento o un pienso que incorpora la semilla de la reivindicaciïn 18.

20. Un mïtodo para fabricar un alimento o un pienso, que comprende:

(a) procesar la semilla transgïnica de la reivindicaciïn 18 para obtener aceite, e incluir dicho aceite en dicho alimento o pienso; o

(b) incluir la semilla transgïnica de la reivindicaciïn 18 en dicho alimento o pienso.

21. El mïtodo de la reivindicaciïn 20, en el que dicho alimento es un anïlogo de la carne, un anïlogo del queso, un 25 anïlogo de la lecha, o un producto alimentario de cereales.