MUTANTES DE APOACUORINA Y METODOS PARA SU USO.

Mutantes de apoacuorina y métodos para su uso.

La invención proporciona un sensor de calcio basado en la proteína apoacuorina,

en donde se han modificado la posición 119 y las posiciones 24 y/o 157, así como proteínas de fusión que comprenden dicho sensor. La invención también proporciona métodos para detectar calcio en muestras y la concentración de calcio intracelular.

Mutantes de apoacuorina y metodos para su uso.

CAMPO DE LA TÉCNICA

La presente invención se relaciona con sensores de calcio libre intracelular (Ca2+) codificados genéticamente y, en particular, con mutantes de apoacuorina. También se relaciona con métodos para la detección de Ca2+ mediante el uso de sensores de calcio.

ANTECEDENTES

El calcio iónico intracelular (Ca2+) es la molécula señalizadora más ubicua en los organismos vivos y regula una gran cantidad de procesos celulares como la contracción muscular, la secreción de neurotransmisores y hormonas, la expresión génica, la división celular, la diferenciación y la apoptosis. Por su importante papel en todas estas funciones, el Ca2+ está finamente regulado y alteraciones en su homeostasis pueden conducir a situaciones patológicas relevantes en ciertas enfermedades como la enfermedad de Alzheimer, la diabetes, el cáncer o la migraña.

Para poder estudiar estas funciones es esencial poder monitorizar el Ca en el lumen de las organelas de alto contenido de calcio de forma fiable. El retículo endoplásmico (RE, también llamado sarcoplásmico en las células musculares) es el principal reservorio intracelular de Ca2+, aunque el complejo de Golgi y los lisosomas también son capaces, en menor medida, de almacenar y liberar Ca2+ Esto requiere disponer de un sensor que pueda dirigirse específicamente al lumen de esas organelas y cuya afinidad esté en el rango apropiado para poder detectar cambios de Ca2+ en su interior. Además, otras propiedades de un sensor óptimo como un amplio rango dinámico, y una buena relación señal/ruido también son deseables. Actualmente se dispone de un amplio repertorio de indicadores de Ca2+, tanto sintéticos como codificados genéticamente (GECIs, Genetically Encoded Ca2+ Indicators) (Zhang et al., 2002, Nat Rev Mol Cell Biol 3:906-18) .

Los indicadores sintéticos ofrecen muchas ventajas para monitorizar la concentración de Ca2+ en el citosol ya que pueden introducirse en las células de forma rápida y sencilla (en su forma acetoximetilester) , atravesando la membrana y quedando atrapados en el interior celular gracias a las esterasas citosólicas. A pesar de disponer de varios indicadores de baja afinidad, requeridos para medir de forma directa en organelas de alto contenido de calcio, su uso para medir en el interior de las organelas es bastante más limitado, debido a la dificultad de que el indicador se cargue de forma específica en una organela concreta. Se han descrito algunos trucos experimentales para remediar esta limitación, como son la incubación del indicador a 37 ͼC, en lugar de a 25 ͼC, como es habitual, para favorecer su compartimentalización en organelas con alta [Ca2+]. Sin embargo, esto no resuelve el problema de la especificidad, pudiendo cargarse el colorante en distintos compartimentos de alto contenido Ca2+ como por ejemplo, el complejo de Golgi o las vesículas de secreción, y permaneciendo una gran fracción del colorante en el citosol. Esta última debe eliminarse permeabilizando la membrana plasmática, lo cual podría alterar las propiedades del RE e imposibilitaría su uso en células intactas, limitando así enormemente las posibilidades de la técnica. Otros métodos alternativos de carga como la microinyección también aducen de la misma limitación. Precisamente el método pionero empleado para medir la concentración de Ca2+ en el lumen del RE ([Ca2+]RE) utilizó el indicador fluorescente de baja afinidad Mag-Fura 2 en células permeabilizadas (Hofer and Machen, 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90:2598-2602) . En los últimos años se han descrito intentos originales para enriquecer la fracción de indicador atrapado en el interior de las organelas mediante la sobreexpresión de esterasas en el lumen del RE, favoreciendo de esta forma la carga del colorante de calcio en el interior de esta organela.

Al contrario de los indicadores de Ca2+ sintéticos, la principal ventaja de los GECIs es que, al ser proteínas, pueden dirigirse a compartimentos subcelulares mediante su fusión con péptidos de direccionamiento. Por esta razón, al contrario que las medidas en el citosol, para medir en las organelas son mucho más ampliamente utilizados que los indicadores sintéticos. Los GECIs pueden ser proteínas bioluminiscentes o fluorescentes. Entre los primeros, la fotoproteína acuorina, procedente de la medusa Aequorea victoria, fue el primer sensor de calcio proteico y actualmente sigue siendo el sensor más utilizado para medir Ca2+ en organelas. Al igual que otras proteínas de celenterados como la obelina y la mnemiopsina, es una proteína quimioluminiscente que emite fotones cuando se une al Ca2+. La acuorina contiene en su estructura tres dominios funcionales de unión a Ca2+ del tipo hélice-giro-hélice denominadas “manos EF” con una gran homología con los dominios de otras proteínas fijadoras de Ca2+ de la misma familia como la calmodulina, la troponina y la parvalbúmina. La unión de 3 átomos de Ca2+ provoca un cambio conformacional en la apoproteína que resulta en una reacción intramolecular de peroxidación del subgrupo prostético, la celenterazina, al que está unido covalentemente, produciendo celenteramida y emitiendo luz azul (λ = 470 nm) y CO2. La acuorina nativa es capaz de medir [Ca2+] comprendidas entre 0.1 y 10 µM. Desde su clonación en 1985, la acuorina se ha dirigido a distintas organelas, incluyendo a las de alto contenido de Ca2+ como el RE, el complejo de Golgi y la vesícula de secreción. Para poder medir el contenido de Ca2+ en estos casos se ha reducido la afinidad de la acuorina por el Ca2+ mediante la sustitución del residuo aspartato 119 por alanina (Kendall et al., 1992, Biochem Biophys Res Commun 187:10917; Montero et al., 1995, EMBO J 14:5467-75) .

Las medidas de bioluminiscencia basadas en la acuorina poseen muchas ventajas como son la excelente señal/ruido debido a que el fondo es muy bajo ya que las células de mamífero no expresan proteínas bioluminiscentes de forma natural. Además, a diferencia de los indicadores fluorescentes, no se necesita luz de excitación, por lo que no existen problemas de fototoxicidad. La principal desventaja de la acuorina reside en la baja emisión de luz, debido a que cada molécula de acuorina emite un solo fotón, en contraste con los indicadores sintéticos fluorescentes, que pueden emitir hasta 104 fotones antes de apagarse. Por otra parte, la reacción de oxidación y emisión de luz de la acuorina es prácticamente irreversible, lo que hace que la apoproteína se consuma a medida que va uniendo calcio. Esto se agrava en el caso de su localización en organelas de alto Ca2+, por lo que antes de reconstituir la apoacuorina con su co-factor celenterazina, debe vaciarse el RE completamente de todo su Ca2+, impidiéndose de este modo las medidas basales. Además, estas limitaciones impiden registrar durante largos periodos de tiempo. Todos estos factores hacen que la acuorina sea un buen indicador para medir calcio en organelas, pero poco apropiado para estudios de imagen en célula única en organelas de alto Ca2+, requiriéndose en este caso un equipamiento altamente especializado.

Entre los GECIs fluorescentes se distinguen los basados en la transferencia de energía de resonancia de Föster (FRET) y los que sufren un cambio del espectro de emisión o excitación en función de la [Ca2+]. Los primeros consisten en dos proteínas fluorescentes (derivadas de la proteína verde fluorescente, o GFP, originaria de la medusa Aequorea victoria) , en las que el espectro de emisión de una se solapa con el de excitación de la otra. La sensibilidad a Ca2+ la concede la calmodulina y un péptido de unión a calmodulina (el péptido M13) (Miyawaki et al., 1997, Nature 388:882-7) . En el caso de la familia más emblemática de este grupo, los camaleones, la calmodulina y el M13 se sitúan entre las dos proteínas fluorescentes, de manera que cuando la calmodulina se une al Ca2+, esta sufre un cambio conformacional que la permite, a su vez, engarzar al péptido M13 (asemejándose a una lengua) , acercando de este modo las proteínas fluorescentes y favoreciendo que haya FRET.

Dentro de la familia de los camaleones, la versión más optimizada es la proteína D1RE, que consta de las proteínas fluorescentes ciano (CFP) y citrina (Palmer et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101:17404-9) . Se ha dirigido al RE y la baja afinidad por el Ca2+ se ha logrado rediseñando la región de interacción entre la calmodulina y su péptido de unión. Esto solventa una de las limitaciones del camaleón original, la afectación del sensor por la calmodulina endógena, aunque no soluciona su pequeño rango dinámico. La última versión del camaleón es el D3 en la que la citrina se ha sustituido por la proteína fluorescente... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 (apoacuorina) , en donde

(i) en una primera posición 119 de SEQ ID NO: 1 el aminoácido es cualquier aminoácido excepto Asp, y

(ii) en una segunda posición 24 de SEQ ID NO: 1 el aminoácido es cualquier aminoácido excepto Asp y/o en posición 157 de SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoácido excepto Ser.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, en donde el aminoácido en una primera posición 119 de SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoácido excepto un aminoácido con carga negativa.

3. Polipéptido según la reivindicación 2, en donde el aminoácido en una primera posición 119 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido con carga neutra.

4. Polipéptido según la reivindicación 3, en donde el aminoácido en una primera posición 119 de SEQ ID NO: 1 es Ala.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el aminoácido en una segunda posición 24 de SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoácido excepto un aminoácido con carga negativa.

6. Polipéptido según la reivindicación 5, en donde el aminoácido en una segunda posición 24 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn, Glu y Gln.

7. Polipéptido según la reivindicación 6, en donde el aminoácido en una segunda posición 24 de SEQ ID NO: 1 es Asn.

8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el aminoácido en una segunda posición 157 de SEQ ID NO: 1 es cualquier aminoácido excepto un aminoácido con carga negativa.

9. Polipéptido según la reivindicación 8, en donde el aminoácido en una segunda posición 157 de SEQ ID NO: 1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn, Glu y Gln.

10. Polipéptido según la reivindicación 9, en donde el aminoácido en una segunda posición 157 de SEQ ID NO: 1 es Asn.

11. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde

(i) el aminoácido en posición 119 es Ala,

(ii) el aminoácido en posición 24 es Asn, y

(iii) el aminoácido en posición 157 es Asn.

12. Proteína de fusión que comprende

(i) un primer polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y

(ii) un segundo polipéptido fluorescente, en donde dichos primer y segundo dominios se encuentran unidos a través de un péptido enlazador flexible.

13. Proteína de fusión según la reivindicación 12, en donde el segundo polipéptido fluorescente es el polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 33 (GFPuv) o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

14. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en donde el péptido enlazador es un péptido con secuencia SEQ ID NO: 42.

15. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que comprende adicionalmente al menos un péptido de localización en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

16. Polipéptido o proteína de fusión según la reivindicación 15, en donde el péptido de localización se selecciona del grupo consistente en un péptido de localización en el retículo endoplásmico, un péptido de señalización mitocondrial, un péptido de localización nuclear y un péptido de señalización en el complejo de Golgi.

17. Polipéptido o proteína de fusión según la reivindicación 16, que comprende un primer péptido señal de direccionamiento a la ruta secretora y un segundo péptido señal de retención en el retículo endoplásmico.

18. Polipéptido o proteína de fusión según la reivindicación 17, en donde el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico se selecciona del grupo consistente en un péptido de retención en el retículo endoplásmico en posición carboxilo terminal y una secuencia de interacción con BiP.

19. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 18 o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en donde el péptido señal de direccionamiento a la ruta secretora se selecciona del grupo consistente en el péptido señal de la calreticulina y el péptido señal de la inmunoglobulina Igγ2b, en donde el péptido de retención en el retículo endoplásmico es el péptido KDEL (SEQ ID NO: 27) y/o en donde la secuencia interacción con BiP comprende los dominios VDJ y CH1 de la cadena pesada de la inmunoglobulina Igγ2b.

20. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 19 o proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, en donde el péptido señal de direccionamiento a la ruta secretora es el péptido señal de la calreticulina, y en donde el péptido de retención en el retículo endoplásmico es el péptido KDEL (SEQ ID NO: 27) .

21. Ácido nucleico que codifica para el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 20 o la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20.

22. Casete de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 21, donde dicho ácido nucleico se encuentra bajo control de un sistema de transcripción y/o traducción apropiado.

23. Plásmido que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 21 o el casete de expresión según la reivindicación 22.

24. Célula hospedadora que comprende ácido nucleico según la reivindicación 21, el casete de expresión según la reivindicación 22, o el plásmido según la reivindicación 23.

25. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 20 o la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20 para la detección de Ca2+ en una muestra.

26. Método para la determinación de la concentración de Ca2+ en una muestra que comprende

(v) poner en contacto dicha muestra con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 20,

(vi) poner en contacto dicho polipéptido con un co-factor específico para el mismo,

(vii) detectar la luminiscencia emitida por dicho polipéptido, y

(viii) determinar la concentración de Ca2+ a partir de la variación en la intensidad de la luminiscencia con respecto a la intensidad de la luminiscencia en ausencia de Ca2+.

27. Método para la determinación de la concentración de Ca2+ en una muestra que comprende

(iv) poner en contacto dicha muestra con una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20,

(v) detectar la luminiscencia emitida por dicho primer polipéptido en respuesta a la puesta en contacto dicha proteína de fusión con un co-factor específico para dicho primer polipéptido, o, alternativamente detectar la fluorescencia emitida por dicho segundo polipéptido en respuesta a la excitación de la muestra a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo polipéptido, y

(vi) determinar la concentración de Ca2+ a partir de la variación en la intensidad de la luminiscencia o fluorescencia con respecto a la intensidad de la luminiscencia o fluorescencia en ausencia de Ca2+.

28. Método para la detección intracelular de Ca2+ en una célula o población celular que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 20, en donde dicho método comprende

(iii) poner en contacto dicho polipéptido con un co-factor específico del mismo, y

(iv) detectar la luminiscencia emitida por dicho polipéptido,

en donde una variación en la intensidad de la luminiscencia emitida por la célula o población celular con respecto a un valor de referencia es indicativo de la presencia de Ca2+ en la célula o población celular.

29. Método para la detección intracelular de Ca2+ en una célula o población celular que comprende una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, en donde dicho método comprende (a) detectar la luminiscencia emitida por dicho primer polipéptido en respuesta a la puesta en contacto dicha proteína de fusión con un co-factor específico para dicho primer polipéptido,

o alternativamente (b) detectar la fluorescencia emitida por dicho segundo polipéptido en respuesta a la excitación de la célula o población celular a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo polipéptido en donde una variación en la intensidad de la luminiscencia o fluorescencia emitida por la célula o población celular con respecto a un valor de referencia es indicativo de la presencia de Ca2+ en la célula o población celular.

30. Método para la detección de variaciones en la concentración de Ca2+ intracelular en una célula o población celular a lo largo del tiempo que comprende

(v) proporcionar una célula o población celular en donde dicha célula o células comprenden un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 20,

(vi) poner en contacto dicho polipéptido con un co-factor específico del mismo,

(vii) determinar a un primer tiempo la luminiscencia emitida por la célula o población celular, y

(viii) determinar a un segundo tiempo la luminiscencia emitida por la célula o población celular en donde una variación en la intensidad de la señal emitida en (iv) con respecto a la intensidad de la señal emitida en (iii) es indicativo de una variación en la concentración de Ca2+ en la célula o población celular.

31. Método para la detección de variaciones en la concentración de Ca2+ intracelular en una célula o población celular a lo largo del tiempo que comprende (i) proporcionar una célula o población celular en donde dicha célula o células comprenden una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20,

(ii.a) determinar a un primer tiempo la luminiscencia emitida por la célula o población celular en respuesta a la puesta en contacto dicha proteína de fusión con un co-factor específico para dicho primer polipéptido, y

(iii.a) determinar a un segundo tiempo la luminiscencia emitida por la célula o población celular en respuesta a la puesta en contacto dicha proteína de fusión con un co-factor específico para dicho primer polipéptido,

o alternativamente (ii.b) determinar a un primer tiempo la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo polipéptido y

(iii.b) determinar a un segundo tiempo la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo polipéptido en donde una variación en la intensidad de la señal emitida en (iii.a) con respecto a la intensidad de la señal emitida en (ii.a) o una variación en la intensidad de la señal emitida en (iii.b) con respecto a la intensidad de la señal emitida en (ii.b) es indicativo de una variación en la concentración de Ca2+ en la célula o población celular.

32. Método de identificación de un compuesto con capacidad de modulación de la concentración de Ca2+ en una célula o población celular, que comprende (iii) poner en contacto un compuesto candidato con una célula o población celular en donde dicha célula o células comprenden un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 15 a 20,

(iv) determinar la luminiscencia emitida por la célula o población celular en respuesta a la puesta en contacto dicho polipéptido con un co-factor específico para dicho polipéptido,

en donde una alteración en la intensidad de luminiscencia determinada en la etapa (ii) con respecto a la intensidad de luminiscencia emitida en ausencia de dicho compuesto candidato es indicativo de que dicho compuesto es capaz de modular la concentración de Ca2+.

33. Método de identificación de un compuesto con capacidad de modulación de la concentración de Ca2+ en una célula o población celular, que comprende (iii) poner en contacto un compuesto candidato con una célula o población celular en donde dicha célula o células comprenden una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20,

(iv) determinar la luminiscencia emitida por la célula o población celular en respuesta a la puesta en contacto dicha proteína de fusión con un co-factor específico para dicho primer polipéptido,

o alternativamente determinar la fluorescencia emitida por la célula o población celular en respuesta a una excitación de dicha célula o población a una longitud de onda correspondiente a la longitud de onda de excitación de dicho segundo polipéptido,

en donde una alteración en la intensidad de luminiscencia o fluorescencia determinada en la etapa

(ii) con respecto a la intensidad de fluorescencia emitida en ausencia de dicho compuesto candidato es indicativo de que dicho compuesto es capaz de modular la concentración de Ca2+.

34. Método según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30 o 32, en donde dicho polipéptido se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

35. Método según cualquiera de las reivindicaciones 29, 31 o 33, en donde dicha proteína de fusión se localiza en un compartimento intracelular u orgánulo específico.

36. Método según cualquiera de las reivindicaciones 34 o 35, en donde dicho compartimento intracelular u orgánulo es el retículo endoplásmico o sarcoplásmico.

Figura 1 Figura 2

MUTACIONES EGTA 100 2M CaCl2 100 2M CaCl2 1 mM RATIO RATIO

Numeración Aminoácido mutado 390 nm 485 nm 390 nm 485 nm 390 nm 485 nm 100 2M 1 mM 1mM/ 100 2M

1 (D24H, D119A) 10382 3887 10843 4136 11188 4357 1, 0188 1, 0402 1, 0210

2 (D24N, D119A) 17789 7290 23981 11455 20696 17508 1, 1796 2, 0844 1, 7673

3 (D24V, D119A) 18570 7680 17465 18227 14628 15699 2, 5266 2, 6044 1, 0302

4 (V25P, D119A) 7137 3060 6079 8623 6091 8391 3, 3144 3, 2138 0, 9707

5 (N28Q, D119A) 8520 3642 8310 3551 9365 4167 1, 0018 1, 0460 1, 0442

6 (N28V, D119A) 7188 2813 7930 3095 7215 2863 0, 9984 1, 0140 1, 0163

7 (D35Q, D119A) 17963 7834 16269 15565 15630 16485 2, 1992 2, 4108 1, 0962

8 (Y38S, D119A) 17191 7411 14349 14871 16683 16462 2, 4049 2, 2892 0, 9522

9 (D117N, D119A) 885 264 689 206 702 216 0, 9977 1, 0217 1, 0255

10 (D117V, D119A) 19002 8361 13617 14256 13619 14435 2, 3929 2, 4232 1, 0124

11 (D119K) 18577 7816 15637 13539 17171 16403 2, 0569 2, 2695 1, 1034

12 (D119I) 12583 5335 10826 6541 9298 6227 1, 4262 1, 5063 1, 0552

13 (D119A, N121L) 24245 9623 18923 21864 16280 21761 2, 9328 3, 3660 1, 1517

14 (D119A, E128K) 15744 6274 12779 12776 14271 14828 2, 5091 2, 6100 1, 0404

15 (D119A, E128R) 7710 2989 6730 6847 6404 7233 2, 6256 2, 9130 1, 1103

16 (D119A, D153L) 18914 7678 13713 13250 12535 11947 2, 3732 2, 3445 0, 9893

17 (D119A, D155K) 17088 7203 16549 15719 14885 15221 2, 2598 2, 4418 1, 0808

18 (D119A, E156N) 13448 5376 10663 10583 11132 11333 2, 4848 2, 5488 1, 0257

19 (D119A, E156P) 724 270 876 321 810 283 0, 9810 0, 9419 0, 9634

20 (D119A, S157Q) 38016 17775 34042 31463 6601 7838 1, 9855 2, 5533 1, 2854

21 (D119A, D161K) 128 66 114 63 136 76 1, 0717 1, 1121 1, 0488

22 (D119A, E164K) 8137 3597 6144 6053 6015 6453 2, 2352 2, 4338 1, 0889

Figura 3 Figura 4