Composición lista para usar seca y estabilizada que contiene enzimas de polimerización de ácidos nucleicos para aplicaciones en biología molecular.

Una composición desecada o liofilizada adecuada para su dilución con un disolvente apropiado que comprende una enzima de polimerización de ácidos nucleicos aislada,

estabilizada para soportar la liofilización y el almacenamiento a una temperatura de hasta 55 ºC, en la que dicha composición tiene:

- una concentración de enzima de polimerización de ácidos nucleicos en el intervalo de 0,4

- 10000 U/ml,

- celobiosa en una concentración en el intervalo de 50 mM (17,115 g/l) a 500 mM (171,15 g/l),

- un tampón, y

- en la que dicha enzima de polimerización de ácidos nucleicos aislada es una ADN polimerasa seleccionada entre el grupo que consiste en: Taq Polimerasa, Hot Start Polimerasa o fragmentos activos de las mismas; y en la que las concentraciones se refieren a la composición antes de su desecado o liofilización.

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DESCRIPCIÓN

Composición lista para usar seca y estabilizada que contiene enzimas de polimerización de ácidos nucleicos para aplicaciones en biología molecular Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a la estabilización de enzimas de polimerasa de ácidos nucleicos y a la preparación de composiciones y kits de reacción listos para usar que contienen un estabilizante similar a la polimerasa, que además se pueden usar con fines de diagnóstico.

Técnica anterior [0002] La síntesis de ácidos nucleicos in vivo e in vitro se controla mediante la replicación exacta de las hebras, en las que cada cadena de ácido nucleico única determina el orden de los nucleótidos en una hebra perfectamente complementaria. El mecanismo específico para la replicación del ADN implica el uso, y se lleva a cabo, mediante una familia de enzimas conocida como polimerasas.

Las polimerasas, purificadas a partir de diversos organismos, se usan normalmente en investigación y diagnóstico, en particular, con la aparición de diversos sistemas de amplificación de genes, tales como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR -MuIlis et al. Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195; Nº 4.683.202, y Nº 4.804.159) .

La configuración básica de la PCR consiste en dos cebadores sintetizados, un molde de ácido nucleico y la enzima polimerasa. Cada cebador es complementario a una región en el ácido nucleico diana, o mejor aún, a una de las dos hebras complementarias. La enzima polimerasa es obviamente una parte crítica del sistema de amplificación debido a su capacidad para añadir nucleótidos secuencialmente en una dirección 3'; uniéndolos a un grupo hidroxilo del cebador de polinucleótidos específico de dianas que es capaz de unirse a la hebra molde a través de enlaces de hidrógeno.

Una mezcla de amplificación convencional puede tener la siguiente composición: dNTP, un tampón, MgCI2, un cebador directo, un cebador inverso, Taq polimerasa, ADN y H2O. La mezcla de reacción se debe calentar a 9095 º C para desnaturalizar la doble hélice del ADN molde. Después de la etapa de desnaturalización, la temperatura se reduce a 50 -60 º C para permitir la hibridación de los cebadores a la cadena complementaria; la polimerasa completa el proceso mediante el alargamiento de dichos cebadores en una etapa conocida habitualmente como extensión.

Las enzimas usadas en reacciones de PCR se han aislado a partir de organismos termófilos y por lo tanto son estables a altas temperaturas. Sin embargo, incluso estas enzimas altamente termoestables se pueden inactivar mediante agentes químicos, proteasas, o cambios ambientales.

El uso de enzimas termoestables, al igual que con otras enzimas, a menudo requiere el uso simultáneo de condiciones de desnaturalización tales como altas temperaturas, como es el caso con la PCR, mezclas acuosas con concentraciones subóptimas de cofactores y sustratos, y un pH no óptimo para la actividad máxima de la enzima.

Este escenario sugiere que la estabilización de las enzimas es muy deseada y necesaria para una conservación de las enzimas a largo plazo, especialmente si se incluyen en mezclas acuosas junto con otros reactivos y mezclas de reacción listos para usar para la amplificación de ácidos nucleicos.

Se conoce un número de técnicas para la estabilización de polimerasas y se han descrito en patentes y aplicaciones. Dichas técnicas incluyen modificación química de las enzimas, inmovilización sobre soportes sólidos, uso de aptámeros, ingeniería genética de las enzimas y adición de agentes estabilizantes.

Un grupo de sustancias que han demostrado una actividad de estabilización son los tensioactivos que funcionan en la superficie de contacto entre la forma activa de la enzima y el entorno acuoso en el que están contenidos.

El método habitual para estabilizar las enzimas usadas en técnicas de biología molecular es mediante el almacenamiento de una preparación líquida de cada enzima en una solución que contiene glicerol al 50 % y un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o β-mercaptoetanol a -20 º C. El procedimiento es suficiente para conservar la actividad de las enzimas durante muchos meses con una pérdida mínima de actividad. En contraste, la actividad enzimática se pierde rápidamente cuando se almacena a temperatura ambiente o a +4 º C.

Redway y Lapage (Cr y obiology 11, 73-79 (1974) ) comparan hidratos de carbono diferentes, que incluyen glucosa y trehalosa, como medios de suspensión en la conservación a largo plazo de bacterias liofilizadas. La Patente de Estados Unidos Nº 5.834.254 usa los disacáridos sacarosa y trehalosa como crioprotectores para

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estabilizar la actividad de las enzimas ADN polimerasa y ARN polimerasa.

Se ha demostrado que los detergentes no iónicos tales como Triton X-100 y Tween 20 estabilizan la actividad de la ADN polimerasa. La solicitud de patente EP 776.970 A1 describe el uso de detergentes no iónicos, que incluyen Tween 20® y NP-40® para estabilizar la actividad de las ADN polimerasas termoestables. Además, se ha demostrado que el dodecil sulfato de sodio (SDS) a concentraciones bajas estabiliza la actividad enzimática.

Los métodos para la conservación de enzimas que les permiten tolerar la exposición prolongada a la temperatura ambiente o una exposición breve a temperaturas más elevadas, siguen siendo la única limitación real para una gestión más fácil y más rentable de los envíos postales y uso en nuevos campos. Las enzimas, y en particular las polimerasas, incluyendo los derivados de organismos termófilos, es decir, los que se usan normalmente para las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) , se han transportado hasta el momento a temperaturas inferiores a +2-8 º C, y normalmente a -20 º C.

De los métodos para la conservación de materiales biológicos, hasta ahora se ha usado la liofilización para conservar alimentos, membranas biológicas, células, macromoléculas biológicas e incluso enzimas.

El proceso de liofilización implica la eliminación de agua de una muestra congelada, es decir, la evaporación del componente acuoso del sólido sin pasar por el estado líquido, en condiciones de presión inferiores a las condiciones de temperatura ambiente.

Las preparaciones de proteínas normalmente se congelan antes de su desecación para reducir las distorsiones estructurales debido a la desecación.

Una liofilización incompletamente seca, es decir, una que todavía contiene un bajo porcentaje de agua, parece asegurar una mejor conservación que una completamente desecada, particularmente si va seguido de conservación a una temperatura no superior a +4-10 º C. Incluso en estas condiciones, sin embargo, existe una pequeña pérdida de actividad de la enzima. Algunas enzimas tales como las polimerasas, sin embargo, se inactivan completamente después de la liofilización en ausencia de un crioprotector, independientemente del tipo de liofilización (seca o de otro modo) .

Un número de sustancias o aditivos con actividad crioprotectora se ha usado o propuesto para estabilizar polimerasas. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.614.387 y la patente de Estados Unidos Nº 5.834.254 describen métodos y composiciones para preparar composiciones de enzimas liofilizadas estables para amplificar ácidos nucleicos en los que se usaron trehalosa y/o polivinilpirrolidona (PVP) como agentes crioprotectores.

El análisis de la técnica conocida y los productos actualmente en el mercado muestra que el problema de la conservación de enzimas de polimerización y el potencial para simplificar la preparación de las mezclas de reacción de polimerización en cadena (y por lo tanto, la normalización de las reacciones de PCR incluso en el entorno de laboratorio) son de gran actualidad y en continuo desarrollo.

En el mercado está disponible un sistema conocido como Perlas para PCR puRe Taq Ready-To-Go (GE Healthcare) que consiste en una formulación liofilizada mezclada previamente en una sola dosis para amplificaciones de PCR convencionales. Sin embargo, el sistema tiene la limitación de que se prepara con una Taq polimerasa específica (puRe Taq polimerasa) que se describe como la enzima directora por su estabilidad y pureza. Por el contrario, el método propuesto de la presente invención se puede usar con todas las polimerasas porque la celobiosa es capaz de estabilizar y proteger todas las Taq polimerasas, tanto si son polimerasas simples o Hot Start polimerasas o incluso sus fragmentos activos tales como Klenow.

Resumen [0022] La presente invención se refiere a una... [Seguir leyendo]

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1. Una composición desecada o liofilizada adecuada para su dilución con un disolvente apropiado que comprende una enzima de polimerización de ácidos nucleicos aislada, estabilizada para soportar la liofilización y el almacenamiento a una temperatura de hasta 55 º C, en la que dicha composición tiene:

- una concentración de enzima de polimerización de ácidos nucleicos en el intervalo de 0, 4 -10000 U/ml, -celobiosa en una concentración en el intervalo de 50 mM (17, 115 g/l) a 500 mM (171, 15 g/l) , -un tampón, y -en la que dicha enzima de polimerización de ácidos nucleicos aislada es una ADN polimerasa seleccionada entre el grupo que consiste en: Taq Polimerasa, Hot Start Polimerasa o fragmentos activos de las mismas; y en la que las concentraciones se refieren a la composición antes de su desecado o liofilización.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende celobiosa 250 mM y 2 Unidades de enzima de polimerización de ácidos nucleicos.

3. Una composición adecuada para su dilución con un disolvente apropiado, que comprende una enzima de polimerización de ácidos nucleicos aislada estabilizada para soportar la liofilización y el almacenamiento a una temperatura de hasta 55 º C, en la que dicha composición tiene:

- una concentración de enzima de polimerización de ácidos nucleicos en el intervalo de 0, 4 -10000 U/ml, -celobiosa en una concentración en el intervalo de 50 mM a 500 mM, -un tampón, dNTP, KCI, MgCI2, y -en la que dicha enzima de polimerización de ácidos nucleicos aislada es una ADN polimerasa seleccionada entre el grupo que consiste en: Taq Polimerasa, Hot Start Polimerasa o fragmentos activos de las mismas.

4. La composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 3, en la que dicho tampón es Tris HCI.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende adicionalmente uno o más de los siguientes componentes (i-iii) :

i. estabilizantes seleccionados entre el grupo que consiste en: tensioactivos y/o azúcares no reductores;

ii. agentes reductores seleccionados entre el grupo que consiste en: (3-mercaptoetanol, DTT;

iii. al menos una sonda, marcada opcionalmente.

6. Uso de la composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 3 para la amplificación de ácidos nucleicos.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho proceso de amplificación se lleva a cabo de una forma automatizada.

8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7 para realizar PCR, PCR en Tiempo Real, Análisis de curvas de fusión, análisis de Fusión de Alta Resolución, Secuenciación, PCR Cuantitativa Fluorescente, PCR Multiplex, Amplificación de Todo el Genoma o Amplificación Isotérmica.

9. Un proceso para la amplificación de ácidos nucleicos que comprende las etapas de:

a. reconstituir la composición de acuerdo con la reivindicación 1 en agua o en un tampón;

b. añadir cebadores específicos para un ADN diana;

c. añadir un molde de ácido nucleico;

d. añadir uno o más de los reactivos seleccionados entre el grupo que consiste en: KCI, MgCI2, dNTP, al menos una sonda marcada opcionalmente, agentes reductores y estabilizantes adicionales.

10. Un proceso para la amplificación de ácidos nucleicos que comprende las etapas de:

a. reconstituir la composición de acuerdo con la reivindicación 3 en agua o en un tampón;

b. añadir cebadores específicos para un ADN diana;

c. añadir un molde de ácido nucleico;

d. opcionalmente, añadir al menos una sonda marcada opcionalmente, agentes reductores y estabilizantes adicionales.

11. Un producto listo para usar que comprende:

a. La composición desecada o liofilizada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3;

b. un disolvente para reconstituir dicha composición.

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12. Un kit para amplificación por PCR de una muestra de ADN que comprende la composición de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 3 y opcionalmente instrucciones para la reconstitución y uso de la enzima en una reacción en cadena de la polimerasa.

13. Uso de celobiosa para la conservación de una polimerasa de ácidos nucleicos durante la liofilización y el almacenamiento a largo plazo a una temperatura de hasta 55 º C.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha polimerasa de ácidos nucleicos es la ADN polimerasa.