Métodos de inmunoensayo mejorados.

Un método in vitro para determinar un perfil de anticuerpos en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto mamífero donde dicho anticuerpo es un autoanticuerpo que es un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a enfermedad,

comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antígeno específico para dicho anticuerpo,

(b) detectar la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno y

(c) representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usado en la etapa (a), para construir un perfil de producción de anticuerpos en dicho sujeto bien antes de la aparición de enfermedad, o bien durante la evolución de la enfermedad, donde el método se repite para construir un perfil de producción de anticuerpos.

Métodos de inmunoensayo mejorados

Campo de la invención La invención se refiere en general al campo de los ensayos de diagnóstico o pronóstico y, en particular, se refiere a la optimización de ensayos para la detección de anticuerpos en una muestra que comprende fluido corporal de paciente, en los que dichos anticuerpos se usan como marcadores biológicos de una susceptibilidad a patología o enfermedad.

Antecedentes de la invención Muchos ensayos de diagnóstico, pronóstico y/o control dependen de la detección de un marcador biológico de una susceptibilidad a patología o enfermedad particular. Dichos marcadores biológicos son comúnmente proteínas o polipéptidos que son característicos de una enfermedad particular o están asociados con la susceptibilidad a enfermedad.

En los últimos años se ha hecho evidente que los anticuerpos, y en particular los autoanticuerpos, también pueden servir como marcadores biológicos de enfermedad o susceptibilidad a enfermedad. Los autoanticuerpos son anticuerpos de origen natural dirigidos contra un antígeno que el sistema inmune de un individuo reconoce como extraño aun cuando ese antígeno se originó en realidad en el individuo. Pueden estar presentes en la circulación como autoanticuerpos libres circulantes o en forma de inmunocomplejos circulantes que consisten en autoanticuerpos unidos a su proteína marcadora diana. Las diferencias entre una proteína de tipo silvestre expresada por células “normales” y una forma alterada de la proteína producida por una célula enferma o durante un proceso patológico pueden conducir, en algunos casos, a que la proteína alterada se reconozca por el sistema inmune de un individuo como "no propia" y de este modo genere una respuesta inmune en ese individuo. Ésta puede ser una respuesta inmune humoral (es decir, mediada por células B) que conduzca a la producción de autoanticuerpos inmunológicamente específicos para la proteína alterada.

El documento WO 99/58978 describe métodos para su uso en la detección/diagnóstico del cáncer que están basados en la evaluación de la respuesta inmune de un individuo contra dos o más marcadores tumorales diferentes. Estos métodos implican generalmente poner en contacto una muestra de fluido corporal tomada del individuo con un panel de dos o más antígenos marcadores tumorales diferentes, cada uno derivado de una proteína marcadora tumoral separada, y detectar la formación de complejos de los antígenos marcadores tumorales unidos a autoanticuerpos circulantes inmunológicamente específicos para las proteínas marcadoras tumorales. La presencia de dichos autoanticuerpos circulantes se toma como un indicio de la presencia de cáncer.

Los ensayos que miden la respuesta inmune del individuo respecto a la presencia de proteína marcadora tumoral en términos de la producción de autoanticuerpos proporcionan una alternativa a la medición o detección directa de proteína marcadora tumoral en fluidos corporales. Dichos ensayos constituyen esencialmente una detección indirecta de la presencia de proteína marcadora tumoral. Debido a la naturaleza de la respuesta inmune, es probable que puedan generarse autoanticuerpos por una cantidad muy pequeña de proteína marcadora tumoral circulante y, por consiguiente, los métodos indirectos que dependen de la detección de la respuesta inmune contra marcadores 45 tumorales serán más sensibles que los métodos para la medición directa de marcadores tumorales en fluidos corporales. Por lo tanto, los métodos de ensayo basados en la detección de autoanticuerpos pueden ser de un valor particular pronto en el proceso patológico, y posiblemente también en relación con la exploración de pacientes asintomáticos, por ejemplo en la exploración para identificar individuos "en riesgo" de desarrollar una enfermedad entre una población de individuos asintomáticos, para identificar individuos que han desarrollado una enfermedad entre una población de individuos asintomáticos. Además, el método basado en la detección de autoanticuerpos puede ser de un valor particular pronto en el proceso patológico, y posiblemente también puede usarse para identificar individuos que han desarrollado una enfermedad entre una población de individuos sintomáticos. Además, pueden ser útiles para la detección temprana de una enfermedad recurrente. Los métodos de ensayo también pueden ser de valor en terapias de selección o control para una enfermedad.

Los anticuerpos y autoanticuerpos también pueden servir como marcadores biológicos de otras patologías o susceptibilidades a enfermedad, de las cuales no son sino ejemplos la artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) , cirrosis biliar primaria (PBC) , tiroiditis autoinmune (por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto) , gastritis autoinmune (por ejemplo, anemia perniciosa) , adrenalitis autoinmune (por ejemplo, enfermedad de Addison) , hipoparatiroidismo autoinmune, diabetes autoinmune (por ejemplo, diabetes Tipo 1) , miastenia grave.

Los presentes inventores han reconocido que cuando se usan de modo diagnóstico o pronóstico ensayos basados en la detección de anticuerpos para evaluar la patología, la progresión de la enfermedad o la susceptibilidad a enfermedad de un individuo dentro de una población, pueden surgir dificultades para concebir una metodología de 65 ensayo normalizada apropiada para toda la población de sujetos a explorar, ya que las cantidades absolutas de anticuerpo presente varían radicalmente de un individuo a otro. Esto puede producir una alta incidencia de resultados falsos negativos, por ejemplo entre individuos que tengan una baja cantidad de anticuerpo. De forma similar, existe la dificultad de puntuar resultados positivos verdaderos, ya que la variación en las cantidades absolutas de anticuerpo de un individuo a otro significa que es difícil establecer un umbral para un resultado de ensayo positivo que sea apropiado para todos los individuos dentro de la población explorada.

Los presentes inventores han determinado ahora que el rendimiento y, más específicamente, la utilidad y fiabilidad clínica de ensayos basados en la detección de anticuerpos, particularmente autoanticuerpos, como marcadores biológicos de enfermedad pueden mejorarse espectacularmente por inclusión de una etapa de titulación de antígeno. Por ensayo de la muestra sospechosa de contener anticuerpos contra una serie de cantidades diferentes de antígeno y construcción de una curva de titulación es posible identificar de forma fiable resultados de exploración positivos verdaderos, independientemente de la cantidad absoluta de anticuerpo presente en la muestra. Una estrategia de este tipo es contraria a métodos de la técnica anterior que titulan antígeno simplemente para construir una curva de calibración para permitir la identificación de la concentración de antígeno más apropiada para usar para detectar anticuerpos en muestras de pacientes reales. En estos métodos sólo se propone una medición de un único punto para el diagnóstico real. Por lo tanto, estos métodos no permitirán variaciones en las cantidades del anticuerpo a detectar de un individuo a otro, dando como resultado la incidencia de falsos positivos y falsos negativos que se analiza. Los presentes inventores han descubierto que el método de titulación de antígeno de la invención analizado en la presente memoria tiene mayor especificidad y sensibilidad que medir la reactividad de autoanticuerpos a una única concentración de antígeno, o métodos en los que se titula la muestra de suero más que el antígeno.

Rasmussen et al., Journal of immunological methods, vol. 127 (1990) 139 a 145, describe un ELISA desarrollado para la detección de anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos en circulación (ANCA) .

Sumario de la invención De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un método in vitro para determinar un perfil de anticuerpos en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto mamífero, en el que dicho anticuerpo es un autoanticuerpo que es un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a enfermedad, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antígeno específico para dicho anticuerpo,

(b) detectar la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno y

(c) representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usada en la etapa (a) , para construir un perfil de producción de anticuerpos en dicho sujeto antes de la aparición de enfermedad o durante la evolución de la enfermedad, donde el método se repite para construir un... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para determinar un perfil de anticuerpos en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto mamífero donde dicho anticuerpo es un autoanticuerpo que es un marcador biológico de una 5 patología o susceptibilidad a enfermedad, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con una pluralidad de cantidades diferentes de un antígeno específico para dicho anticuerpo,

(b) detectar la cantidad de unión específica entre dicho anticuerpo y dicho antígeno y

(c) representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada cantidad de antígeno usado en la etapa (a) , para construir un perfil de producción de anticuerpos en dicho sujeto bien antes de la aparición de enfermedad, o bien durante la evolución de la enfermedad, donde el método se repite para construir un perfil de producción de anticuerpos.

2. El método de la reivindicación 1 donde el anticuerpo es un autoanticuerpo específico para una proteína marcadora de tumores.

3. El método de la reivindicación 2, donde el antígeno es una proteína marcadora de tumores o un fragmento antigénico o epítopo del mismo. 20

4. El método de la reivindicación 3, donde la proteína marcadora tumoral es MUC1, MUC16, c-myc, EGRF, p53, ras, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, una citoqueratina, recoverina, una calicreína, una anexina, AFP, GRP78, CA125, mamoglobina o raf.

5. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en el diagnóstico, pronóstico o control de cáncer.

6. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para explorar una población de sujetos humanos asintomáticos para identificar los sujetos que tienen un riesgo aumentado de desarrollar cáncer, donde las muestras para ensayar usando el método son muestras de fluido corporal tomadas de los sujetos, y donde se identifica que los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un control normal que representa el nivel de autoanticuerpos presentes en individuos de control o un nivel de línea basal para ese sujeto, están en riesgo de desarrollar cáncer.

7. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para detectar cambio neoplásico temprano o carcinogénico temprano en un sujeto humano asintomático, donde la muestra para ensayar usando el método es una muestra de fluido corporal tomada del sujeto, y donde la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un control normal que representa el nivel de autoanticuerpos presentes en individuos de control o un nivel de línea basal para ese sujeto, se toma como una indicación de cambio neoplásico temprano o carcinogénico temprano en el sujeto.

8. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para explorar una población de sujetos humanos asintomáticos para identificar los sujetos que han desarrollado un cáncer, donde las muestras para ensayar usando el método son muestras de fluido corporal tomado de los sujetos, y donde se diagnostica que los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un control normal que representa el nivel de 45 autoanticuerpos presente en individuos de control o un nivel de línea basal para ese sujeto, tienen un cáncer.

9. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para ensayar una población de sujetos humanos asintomáticos para identificar los sujetos que han desarrollado un cáncer, donde las muestras para ensayar usando el método son muestras de fluido corporal tomado de los sujetos, y donde se diagnostica que los sujetos que tienen 50 un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un control normal que representa el nivel de autoanticuerpos presente en individuos de control o un nivel de línea basal para ese sujeto, tienen un cáncer.

10. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para controlar el progreso de cáncer u otra enfermedad neoplásica en un paciente, donde la muestra para ensayar usando el método es una muestra de fluido 55 corporal tomada de un paciente humano, y donde el nivel de autoanticuerpos presente en dicho paciente se compara con un control normal que representa el nivel de autoanticuerpos presente en individuos de control o un nivel de línea basal establecido para ese paciente.

11. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para evaluar el pronóstico de un paciente al que 60 se ha diagnosticado cáncer.

12. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para predecir la respuesta de un paciente de cáncer a tratamiento antineoplásico, tal como factor anticrecimiento o terapia de transducción de señal, radioterapia, terapia endocrina, terapia de anticuerpos humanos, quimioterapia o vacunación.

13. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para controlar la respuesta de un paciente de cáncer a tratamiento antineoplásico, tal como factor anticrecimiento o terapia de transducción de señales, radioterapia, terapia endocrina, terapia de anticuerpos humanos, quimioterapia o vacunación.

14. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para seleccionar una vacuna antineoplásica para uso en un paciente con cáncer.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 donde el anticuerpo es un autoanticuerpo característico de o asociado con una enfermedad autoinmunitaria.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1 donde el autoanticuerpo es un autoanticuerpo característico de o asociado con enfermedad de riñón o hepática que conduce a insuficiencia o fallo de uno de los órganos.

17. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 donde el antígeno es una proteína o

polipéptido de origen natural, una proteína o polinucleótido recombinante, una proteína o polipéptido sintético, péptido sintético, mimético peptídico, polisacárido o ácido nucleico.

18. Un método in vitro para realizar el perfil de dos o más anticuerpos en una muestra de ensayo que comprende un fluido corporal de un sujeto mamífero donde al menos uno de dichos anticuerpos es un autoanticuerpo que es un marcador biológico de una patología o susceptibilidad a enfermedad, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con dos o más conjuntos de antígenos, donde cada uno de dichos conjuntos de antígenos es específico para uno de dichos anticuerpos para detectar en la muestra de ensayo y donde cada conjunto de antígenos comprende una pluralidad de diferentes cantidades de dicho antígeno,

(b) detectar la cantidad de unión específica entre dichos anticuerpos y dicho antígenos, y

(c) representar o calcular una curva de la cantidad de dicha unión específica frente a la cantidad de antígeno para cada conjunto de antígenos usados en la etapa (a) , para construir un perfil de producción de anticuerpos en un paciente antes de la aparición de enfermedad o durante el transcurso de la enfermedad.

19. El método de la reivindicación 18 donde la realización del perfil de cada anticuerpo se determina basándose en los valores colectivos de la cantidad de unión específica para todas las concentraciones de antígeno ensayadas para ese anticuerpo.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 donde al menos uno o cada uno de dichos anticuerpos es un 35 autoanticuerpo específico para una proteína marcadora tumoral.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20 donde cada antígeno es una proteína marcadora tumoral o un fragmento antigénico o epítopo del mismo.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21 donde cada una de dichas proteínas marcadoras tumorales se selecciona del grupo que consiste en MUC1, MUC16, c-myc, EGRF, p53, ras, BRCA1, BRCA2, APC, HER2, PSA, CEA, CA19.9, NY-ESO-1, 4-5, CAGE, PSMA, PSCA, EpCam, una citoqueratina, recoverina, una calicreína, una anexina, AFP, GRP78, CA125, mamoglobina y raf.

23. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 en el diagnóstico, pronóstico o control de cáncer.

24. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 para:

(a) explorar una población de sujetos humanos asintomáticos para identificar los sujetos que tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer, donde las muestras para ensayar usando el método son muestras de fluido corporal tomadas de los sujetos, y donde se identifica que los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un control normal que representa el nivel de autoanticuerpos presente en individuos de control o un nivel de línea basal para ese sujeto, están en riesgo de desarrollar cáncer;

(b) detectar cambio neoplásico temprano o carcinogénico temprano en un sujeto humano asintomático, donde la muestra para ensayar usando el método es una muestra de fluido corporal tomada del sujeto, y donde la presencia de un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un control normal que representa el nivel de autoanticuerpos presente en individuos de control o un nivel de línea basal para ese sujeto, se toma como un indicio de cambio neoplásico temprano o carcinogénico temprano en el sujeto;

(c) explorar una población de sujetos humanos asintomáticos para identificar los sujetos que han desarrollado un cáncer, donde las muestras para ensayar usando el método son muestras de fluido corporal tomadas del sujeto, y donde se diagnostica que los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos, en comparación con un control normal que representa el nivel de autoanticuerpos presente en individuos de control o un nivel de línea basal para ese sujeto, tienen un cáncer;

(d) ensayar una población de sujetos humanos sintomáticos para identificar los sujetos que han desarrollado un cáncer, donde las muestras para ensayar usando los métodos son muestras de fluido corporal tomado de los sujetos, y donde se diagnostica que los sujetos que tienen un nivel elevado de autoanticuerpos en comparación con un control normal que representa el nivel de autoanticuerpos presente en individuos de control o un nivel de línea basal para ese sujeto, tienen un cáncer;

(e) controlar el progreso de cáncer u otra enfermedad neoplásica en un paciente, donde la muestra para ensayar usando el método es una muestra de fluido corporal tomada de un paciente humano, y donde el perfil de autoanticuerpos presente en dicho paciente se compara con un control normal que representa el nivel de autoanticuerpos presente en individuos de control o un nivel de línea basal establecido para ese paciente;

(f) evaluar el pronóstico de un paciente al que se ha diagnosticado cáncer;

(g) predecir la respuesta de un paciente de cáncer a tratamiento antineoplásico, tal como factor anticrecimiento

o terapia de transducción de señales, radioterapia, terapia endocrina, terapia de anticuerpos humanos, quimioterapia o vacunación;

(h) controlar la respuesta de un paciente con cáncer a tratamiento antineoplásico, tal como factor anticrecimiento o terapia de transducción de señales, radioterapia, terapia endocrina, terapia de anticuerpos humanos, quimioterapia o vacunación; o (i) seleccionar una vacuna antineoplásica para uso en un paciente con cáncer.