Análisis secuencial de muestras biológicas.

Un método para sondear dianas múltiples en una muestra biológica que comprende una sección de tejido,

método que comprende:

(a) proporcionar una sección de tejido que contiene múltiples dianas;

(b) unir al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo a una o más dianas presentes en la sección de tejido;

(c) unir al menos una sonda de control a una o más dianas presentes en la sección de tejido;

(d) detectar al menos una señal procedente de al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo unida en la etapa (b) y detectar al menos una señal de control procedente de al menos una sonda de control unida en la etapa (c);

(e) aplicar a la muestra de la etapa (d) una disolución que comprende un agente oxidante que desactiva selectivamente la(s) marca(s) de fluoróforo(s) de al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo y no la(s) sonda(s) de control;

(f) unir al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo a una o más dianas presentes en la muestra tras la etapa (e); y

(g) detectar al menos una señal procedente de al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo unida en la etapa (f).

Análisis secuencial de muestras biológicas Antecedentes En la presente memoria se describen métodos para analizar secuencialmente una muestra biológica para discernir, entre otras cosas, la presencia, la ausencia, la concentración y/o la distribución espacial de múltiples dianas biológicas en la muestra biológica.

En biología y en medicina se pueden usar diversos métodos para observar diferentes dianas en una muestra biológica. Por ejemplo, el análisis de proteínas en secciones histológicas y otras preparaciones citológicas se puede llevar a cabo usando las técnicas de histoquímica, inmunohistoquímica (IHC) o inmunofluorescencia. El análisis de proteínas en muestras biológicas también se puede llevar a cabo usando inmunoensayos de estado sólido, por ejemplo, usando las técnicas de inmunotransferencia western blot.

Muchas de las técnicas actuales pueden detectar solo unas pocas dianas a la vez (tal como, IHC o western blots basados en fluorescencia en los que el número de dianas detectables está limitado por el sistema de detección basado en fluorescencia) en una única muestra. Otros análisis de dianas pueden requerir el uso de muestras biológicas adicionales de la fuente lo que limita la capacidad para determinar las características relativas a las dianas, tales como la presencia, la ausencia, la concentración y/o la distribución espacial de múltiples dianas biológicas en la muestra biológica. Además, en determinados casos, puede haber disponible solo una cantidad limitada de muestra para el análisis o la muestra individual puede requerir un análisis adicional. Por lo tanto, se necesitan métodos, agentes y dispositivos capaces de analizar iterativamente una muestra individual.

El documento US 2003/073149 A1 describe composiciones de inmunomarcado y métodos para su uso en la detección y la medida de una o más dianas en una muestra biológica.

El documento WO 02/079771 A1 describe un método para eliminar manchas de metales de transición de muestras biológicas que incluyen proteínas, ADN y ARN.

El documento WO 00/20641 describe un método que comprende combinar tinción morfológica y/o inmunohistoquímica con hibridación in situ de fluorescencia (FISH) en la misma sección de una muestra de tejido.

Breve descripción La presente invención proporciona un método para sondear dianas múltiples en una muestra biológica que comprende una sección de tejido, comprendiendo el método:

(a) proporcionar una sección de tejido que contiene dianas múltiples.

(b) unir al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo a una o más dianas presentes en la sección de tejido;

(c) unir al menos una sonda de control a una o más dianas presentes en la sección de tejido;

(d) detectar al menos una señal procedente de la al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo unida en la etapa (b) y detectar al menos una señal de control procedente de la al menos una sonda de control unida en la etapa (c) ;

(e) aplicar a la muestra de la etapa (d) una disolución que comprende un agente oxidante que desactiva selectivamente la (s) marca (s) de fluoróforo de la al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo y no la (s) sonda (s) de control;

(f) unir al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo a una o más dianas presentes en la muestra después de la etapa (e) ; y

(g) detectar al menos una señal procedente de la al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo unida en la etapa (f) .

Descripción de las figuras FIG. 1: muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 1 en función de la longitud de onda, después de 10 minutos y de 15 minutos.

FIG 2: muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 1, 2 y 3 en función de la longitud de onda.

FIG. 3: muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 4 en función de la longitud de onda, tras 30 minutos y tras 140 minutos.

FIG. 4: muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 5 en función de la longitud de onda, tras 20 minutos, 60

minutos y 210 minutos. FIG. 5: muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 6 en función de la longitud de onda, tras 12 minutos y 16 minutos.

FIG. 6: muestra el espectro de absorbancia de la Muestra 8 en función de la longitud de onda, tras 22 minutos, 70

minutos y 210 minutos.

FIG. 7: muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9a, 10a y 11a en función de la longitud de onda.

FIG. 8: muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 9b y 10b en función de la longitud de onda.

FIG. 9: muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 12a y 12b en función de la longitud de onda.

FIG. 10: muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 13, 14 y 15 en función de la longitud de onda.

FIG. 11: muestra el espectro de absorbancia de las Muestras 16 y 17 en función de la longitud de onda. FIG. 12: muestra las microfotografías (con un aumento de 10x) de la Muestra 18A (antes de modificación de señal) y de la Muestra 18B (después de modificación de señal) .

FIG. 13: muestra las microfotografías (con un aumento de 10x) de la Muestra 19A (antes de modificación de señal) y

de la Muestra 19B (después de modificación de señal) . FIG. 14: muestra las microfotografías de la Muestra 20A (antes de la modificación de señal) y la Muestra 20B (tras modificación de señal) .

FIG. 15: muestra las microfotografías de las Muestras 21A y 21B (antes de la modificación de señal) y la Muestra

21C (tras modificación de señal) . FIG. 16: muestra las microfotografías de las Muestras 22A y 22B (antes de la modificación de señal) y la Muestra 22C (tras modificación de señal) .

FIG. 17: muestra las microfotografías de las Muestras 23 A-E.

FIG. 18: muestra las microfotografías de la Muestra 24A (antes de la modificación de señal) y la Muestra 24B (tras modificación de señal) . FIG. 19: muestra las microfotografías de la Muestra 25A (canales Cy3 y Cy5) , la Muestra 25B (canales Cy3 y Cy5) y

las Muestras 25C-25J. FIG. 20: muestra las microfotografías de las muestras 26A-H. FIG. 21: muestra las microfotografías de las muestras 27A-C. FIG. 22: muestra la representación de la intensidad de píxel media del ruido de fondo para cada ciclo en la obtención

de imágenes del Ejemplo 20. FIG. 23: muestra la comparación entre las microfotografías de las Muestras 28A-C y 29A-C. FIG. 24: muestra las microfotografías de las Muestras 30A-D. FIG. 25: muestra las microfotografías de las Muestras 30C-F. FIG. 26: muestra la representación de la intensidad de píxel media del ruido de fondo para cada ciclo para las

Muestras 30C y 30D. FIG. 27: muestra las microfotografías de las Muestras 31A, 31B y 31C. FIG. 28: muestra las microfotografías de las Muestras 32A, 32B y 32C. FIG. 29: muestra las microfotografías de las Muestras 33, 34, 35 y 36. FIG. 30: muestra los gráficos de dotblot de las muestras 37, 38, 39 y 40. FIG. 31: muestra el gráfico de barras de las intensidades relativas de señal de los dots correspondientes a las

Muestras 37, 38, 39 y 40. FIG. 32: muestra el perfil temporal de los espectros de Cy3 y Cy5.

FIG. 33: muestra los valores de absorbancia de Cy3 en función del tiempo para diferentes concentraciones de H2O2.

FIG. 34: muestra los valores de absorbancia en función del tiempo para diferentes fluoróforos.

FIG. 35: muestra los valores de absorbancia QD 655 en función del tiempo para H2O2.

FIG. 36: muestra el espectro de absorbancia para fluoresceína usando H2O2.

Descripción detallada Para describir más clara y concisamente, y destacar la materia objetivo de la invención reivindicada, se proporcionan las siguientes definiciones para términos específicos, que se usan en la descripción presentada a continuación y en las reivindicaciones anexas.

Las formas singulares “un/uno/una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. Se puede aplicar un lenguaje de aproximación, tal como el usado aquí en toda la especificación y reivindicaciones, para modificar cualquier representación cuantitativa que pudiera variar permisiblemente sin producir un cambio en la función básica a la que se refiere. Por consiguiente, un valor modificado por un término tal como “aproximadamente” no está limitado al valor exacto especificado. A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como el peso molecular, condiciones de reacción, empleados en la especificación y reivindicaciones deben entenderse como modificables... [Seguir leyendo]

1. Un método para sondear dianas múltiples en una muestra biológica que comprende una sección de tejido, método que comprende:

(a) proporcionar una sección de tejido que contiene múltiples dianas;

(b) unir al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo a una o más dianas presentes en la sección de tejido;

(c) unir al menos una sonda de control a una o más dianas presentes en la sección de tejido;

(d) detectar al menos una señal procedente de al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo unida en la etapa (b) y detectar al menos una señal de control procedente de al menos una sonda de control unida en la etapa (c) ;

(e) aplicar a la muestra de la etapa (d) una disolución que comprende un agente oxidante que desactiva selectivamente la (s) marca (s) de fluoróforo (s) de al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo y no la (s) sonda (s) de control;

(f) unir al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo a una o más dianas presentes en la muestra tras la etapa (e) ; y

(g) detectar al menos una señal procedente de al menos una sonda de anticuerpo marcada con fluoróforo unida en la etapa (f) .

2. El método de la reivindicación 1, en el que la disolución es una disolución alcalina.

3. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la disolución de la etapa (e) es una disolución básica que no contiene un agente reductor o un tensioactivo.

4. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que se selecciona el agente oxidante entre peróxido de hidrógeno, permanganato potásico, dicromato sódico, bromo acuoso, yodo-yoduro potásico e hidroperóxido de tbutilo.

5. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que el agente oxidante es peróxido de hidrógeno.

6. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que una o ambas etapas (b) y (f) comprenden la unión de la sección de tejido a una pluralidad de sondas de anticuerpo marcadas con fluoróforo, que comprende cada una un anticuerpo diferente y una marca de fluoróforo diferente.

7. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que las marcas de fluoróforo comprenden un colorante de cianina.

8. El método de cualquier reivindicación precedente, que usa 4’, 6-diaminidino-2-fenilindol como sonda de control.

9. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que las etapas (e) - (g) se repiten una o más veces, preferiblemente al menos 5, al menos 10 ó al menos 20 veces.

10. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la etapa de oxidación (e) se lleva a cabo durante menos de aproximadamente 30 minutos, preferiblemente entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 15 minutos.

11. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una marca de fluoróforo de la etapa (b) es la misma que la al menos una marca de fluoróforo de la etapa (f) .

12. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que un anticuerpo de la etapa (f) une una diana diferente a al menos un anticuerpo de la etapa (b) .

13. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la etapa de oxidación se lleva a cabo sin desactivar más del 20% de la sonda de control.