Derivados de ácidos aureólicos, su procedimiento de obtención y sus usos.

Derivados de ácidos aureólicos, su procedimiento de obtención y sus usos.

La presente invención proporciona una cepa bacteriana que produce compuestos pertenecientes a la família del ácido aureólico, de aplicación en el tratamiento del cáncer o enfermedades neurológicas.

Derivados de ïcidos aureïlicos, su procedimiento de obtenciïn y sus usos CAMPO DE LA INVENCIïN

Esta descripciïn se adscribe al campo farmacïutico y en concreto se refiere a compuestos con aplicaciïn en oncologïa, con estructura quïmica derivada de ïcidos aureïlicos y que se obtienen por fermentaciïn de microorganismos y/o acilaciïn enzimïtica catalizada por lipasas.

ESTADO DE LA TïCNICA

La familia del ïcido aureïlico comprende a un grupo de metabolitos secundarios sintetizados por miembros del gïnero bacteriano Streptomyces. Esta familia estï integrada por la mitramicina (MTM) , las cromomicinas, las olivomicinas, la cromociclomicina, el UCH9 y la durhamicina (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14) .

Los miembros de la familia del ïcido aureïlico presentan interesantes actividades biolïgicas de aplicaciïn farmacïutica, tales como propiedades antibacterianas, antivirales y neuroprotectoras, aunque su principal interïs farmacolïgico reside en su actividad antitumoral. Asï por ejemplo, la MTM tiene aplicaciïn clïnica en el tratamiento de determinados tipos de cïncer, tales como el carcinoma testicular, la leucemia mieloide crïnica y la leucemia mieloide aguda. Tambiïn se ha utilizado en el tratamiento de la enfermedad de Paget y de la hipercalcemia causada por lesiones ïseas asociadas al cïncer (Oncology 1973, 28, 147-163; Biochem. Biophys. Res. Comun. 1993, 195, 1245-1253; Treat. Endocrinol. 2002, 1, 241-257; Treat. Endocrinol. 2003, 2, 273-292) . Ademïs, la MTM y la cromomicina A3 (CRM) se han descrito como potentes inhibidores de la apoptosis neuronal aberrante caracterïstica de ciertos desïrdenes neurolïgicos (Ann. Neurol. 2001, 49, 345-354) , lo que podrïa convertir a estas molïculas en agentes para el tratamiento de enfermedades neurolïgicas tales como accidente cerebrovascular, esclerosis lateral amiotrïfica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis mïltiple y encefalitis vïrica (J. Neurosci. 2004, 24, 10335-10342; J. Biol. Chem. 2006, 281, 16672-16680) . Mïs recientemente, se ha descrito que la MTM en combinaciïn con otros fïrmacos podrïa constituir una nueva terapia antiangiogïnica para el tratamiento del cïncer de pïncreas y otros tipos de cïncer (Cancer Res. 2007, 67, 4878-4885) .

Las diferentes actividades biolïgicas de los ïcidos aureïlicos son consecuencia de su mecanismo de acciïn a nivel celular, que consiste en la uniïn no covalente de estas molïculas (en forma de dïmeros en presencia de iones Mg2+) al surco menor del ADN en regiones con alto contenido GC. De este modo inhiben la transcripciïn gïnica, ya que desplazan a los activadores transcripcionales que se unen a las regiones ricas en GC presentes en determinadas secuencias promotoras (J. Clin. Invest. 1989, 83, 2003-2007; J. Clin. Invest. 1991, 88, 1613-1621) . Tal es el caso de los factores de transcripciïn Sp1, una familia de proteïnas de uniïn al ADN muy importantes para la transcripciïn de muchos genes celulares y virales que contienen cajas GC en sus regiones promotoras. Los factores Sp1 regulan mïltiples funciones biolïgicas, incluyendo supervivencia celular, crecimiento y diferenciaciïn, asï como desarrollo y progresiïn tumoral (J. Cell. Physiol. 2001, 188, 143-160) .

Estructuralmente los compuestos del grupo del ïcido aureïlico poseen una parte cromïfora (aglicïn) de origen policetïnico formada por tres anillos (cuatro en el caso de la cromociclomicina) y una cadena lateral altamente funcionalizada en el carbono 3. Tambiïn presentan (con excepciïn de la olivomicina) un alquilo de cadena corta (metilo,

isobutilo) en el carbono 7. Asimismo, estos compuestos poseen 2-6 desoxiazïcares unidos en forma de trisacïrido o tetrasacïrido (en el carbono 2) y monosacïrido o disacïrido (en el carbono 6) . Los compuestos del grupo del ïcido aureïlico difieren en la naturaleza y el modo de uniïn de sus cadenas glucïdicas, que contienen diferentes 2, 6didesoxiazïcares. Estas variaciones estructurales son las responsables de las sutiles diferencias que existen entre los miembros del grupo en cuanto a su uniïn al ADN y su perfil de actividad biolïgica. Es bien conocido que el patrïn de glicosilaciïn de los fïrmacos antitumorales que actïan uniïndose al ADN, como es el caso de los ïcidos aureïlicos, tiene gran importancia en su actividad biolïgica. Por ello, la obtenciïn de nuevos derivados de MTM con patrones glicosïdicos alterados puede generar fïrmacos con actividad mejorada.

La MTM y la CRM (FIGURA 1) son los miembros mïs representativos de la familia del ïcido aureïlico. La MTM es un fïrmaco antitumoral producido por microorganismos del gïnero Streptomyces, incluyendo Streptomyces argillaceus ATCC 12956. La CRM es producida, entre otros, por Streptomyces griseus ssp. griseus ATCC13276. La biosïntesis de MTM y CRM ha sido ampliamente estudiada en las cepas productoras previamente citadas (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14) . Los agrupamientos gïnicos responsables de la biosïntesis de ambas molïculas han sido secuenciados ïntegramente. Adicionalmente, la inactivaciïn especïfica de muchos de los genes biosintïticos ha permitido obtener informaciïn acerca del mecanismo de biosïntesis de los ïcidos aureïlicos. Asï, se ha descrito que la biosïntesis de estas molïculas comienza con la condensaciïn de 10 unidades de acil-coenzima A para generar un intermediario tetracïclico, denominado premitramicinona. A continuaciïn, 5 unidades de desoxiazïcares son aïadidas de forma sucesiva, generïndose intermediarios tetracïclicos con diferente grado de glicosilaciïn. La acciïn de una oxigenasa en uno de los pasos finales de la biosïntesis tiene como consecuencia la ruptura de uno de los anillos, generando una estructura tricïclica con una cadena lateral alifïtica unida a la posiciïn 3 del aglicïn. Finalmente, la reducciïn de un grupo ceto en la cadena lateral, genera la molïcula final.

En el caso de la CRM cabe destacar la existencia de dos pasos biosintïticos adicionales que suponen la modificaciïn de los azïcares despuïs de haber sido transferidas al aglicïn: una metilaciïn en posiciïn 4B (llevada a cabo por CmmMIII) y dos acetilaciones en posiciones 4A y 4E (catalizadas por CmmA) . La presencia de estos grupos metilo y acetilo en los azïcares de la CRM confiere caracterïsticas especïficas a la uniïn con el ADN, ya que aportan enlaces de hidrïgeno adicionales con los grupos amino de las bases de guanina, incrementando asï la especificidad en la uniïn al ADN (Biochem. 1997, 36, 2291-2299) . La gran importancia de los grupos acetilo en la actividad biolïgica de la CRM quedï de manifiesto con la inactivaciïn del gen cmmA en S. griseus, que permitiï obtener un derivado desacetilado de la CRM que presenta una actividad antitumoral significativamente inferior a la molïcula parental (Mol. Microbiol. 2004, 53, 903-915) . Por ello, la obtenciïn de nuevos derivados de ïcidos aureïlicos con distintos patrones de acilaciïn puede generar fïrmacos con propiedades farmacolïgicas mïs interesantes.

Actualmente existe una gran necesidad de nuevos agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos efectos secundarios indeseables y con mayor selectividad, en comparaciïn con los fïrmacos actualmente en uso. En este sentido, el desarrollo de la tecnologïa del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de investigaciïn para la generaciïn de nuevos compuestos bioactivos mediante la manipulaciïn de genes implicados en la biosïntesis de agentes antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los actinomicetos. Estas tïcnicas tambiïn pueden ser usadas para mejorar la producciïn de compuestos naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del metabolito de interïs.

La manipulaciïn genïtica de microorganismos ha sido ya utilizada para la obtenciïn de nuevos derivados de tipo ïcido aureïlico (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14) . Algunos de estos derivados presentan caracterïsticas mejoradas con respecto a la molïcula parental. Tal es el caso de los derivados obtenidos a partir de Streptomyces argillaceus M7W1, cepa generada a partir de Streptomyces argillaceus mediante inactivaciïn del gen mtmW (US 7, 423, 008 B2; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753) . El gen mtmW codifica una cetorreductasa, y su inactivaciïn da como resultado la acumulaciïn de 3D-desmicarosil-MTM-SK, MTM-SK, MTM-SA y MTM-SDK, molïculas que difieren de la MTM a nivel de la cadena lateral de la posiciïn 3.

La biocatïlisis por su parte es una herramienta muy eficaz para modificar productos naturales complejos y generar diversidad estructural (Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 106-111; Curr. Opin. Biotechnol. 1999, 10, 130-136) . En particular, el... [Seguir leyendo]

1. Compuesto caracterizado por la fïrmula VII:

2. Uso de un compuesto segïn la reivindicaciïn 1 para la elaboraciïn de una composiciïn farmacïutica destinada al tratamiento del cïncer, de la enfermedad de Paget, de enfermedades neurolïgicas, de la hipercalcemia o de la hipercalciuria.

3. Composiciïn farmacïutica caracterizada por comprender un compuesto segïn la reivindicaciïn 1 y sales 15 farmacïuticamente aceptables.

4. Cepa bacteriana Streptomyces argillaceus ΔAH-W- (pMP3*BII) , caracterizada por tener inactivados los genes mtmA, mtmH y mtmW, asï como por poseer un ïcido nucleico adicional que codifica enzimas activos para la biosïntesis de azïcares que no estïn presentes en Streptomyces argillaceus ATCC12956.

5. Cepa bacteriana de la reivindicaciïn 4, caracterizada por poseer un ïcido nucleico adicional contenido en el plïsmido pMP3*BII, el cual codifica enzimas activos para la biosïntesis del azïcar D-digitoxosa y sus intermediarios biosintïticos.

6. Procedimiento para obtener la cepa bacteriana de las reivindicaciones 4 ï 5, que comprende la introducciïn del plïsmido pMP3*BII en Streptomyces argillaceus ΔAH-W-, que codifica enzimas activos para la biosïntesis de azïcares que no estïn presentes en Streptomyces argillaceus ATCC12956.

7. Procedimiento para la obtenciïn de un derivado de ïcido aureïlico segïn la reivindicaciïn 1 que comprende: 30 a. Incubaciïn de una cepa bacteriana de las reivindicaciones 4 ï 5 en un medio de cultivo apropiado; y

b. Aislamiento del derivado de ïcido aureïlico de la reivindicaciïn 1 del caldo de cultivo.

8. Procedimiento para la obtenciïn de derivados acilados del derivado de ïcido aureïlico de la reivindicaion 1, que comprende a. Incubaciïn de la cepa bacteriana Streptomyces griseus ssp. griseus C10GIV en presencia del ïcido aureïlico segïn la reivindicaciïn 1; y

b. Aislamiento de derivados de ïcido aureïlico segïn la reivindicaciïn 1 del caldo de cultivo.

9. Procedimiento para la obtenciïn de derivados acilados del ïcido aureïlico de la reivindicaciïn 1, que comprende reaccionar el ïcido aureïlico segïn la reivindicaciïn 1 con un agente acilante en presencia de una hidrolasa.

10. Procedimiento, de la reivindicaciïn 9, donde la enzima es una lipasa, preferiblemente la fracciïn A o B de la 5 lipasa Candida antarctica.

11. Procedimiento, de cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, donde la enzima estï inmovilizada sobre un soporte, preferiblemente sobreuna resina epoxiacrïlica activada con grupos deca-octilo cuando la enzima es una lipasa.

12. Procedimiento, de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el agente acilante es un ïster, anhïdrido o carbonato.

13. Procedimiento, de la reivindicaciïn 12, donde el agente acilante se selecciona del grupo que consiste en acetato de vinilo, acetato de trifluoroetilo, cloroacetato de vinilo, propanoato de vinilo, butanoato de vinilo, levulinato de acetonoxima, decanoato de vinilo, dodecanoato de vinilo, benzoato de vinilo, crotonato de vinilo, carbonato de dialilo, carbonato mixto de alilo y oxima, carbonato de vinileno, anhïdrido succïnico, adipato de vinilo y sorbato de vinilo.

14. Procedimiento, de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde la reacciïn se realiza empleando como disolvente el propio agente acilante. 20

15. Procedimiento, de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde la reacciïn se realiza empleando como disolvente tetrahidrofurano si el agente acilante es sïlido o si la solubilidad del ïcido aureïlico en el agente acilante es baja.

FIG. 1

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FIG. 55 FIG. 57 FIG. 60

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIïN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, ïnicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripciïn Literatura no patente citada en la descripciïn