Compuestos dendríticos carbosilanos homo y hetero-funcionalizados.

Compuestos dendríticos carbosilanos homo y hetero-funcionalizados.

La invención se refiere a macromoléculas altamente ramificadas denominadas dendrímeros o dendrones, de estructura carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos aniónicos o catiónicos que dan a la macromolécula una carga neta negativa o positiva, respectivamente. Estas moléculas han sido sintetizadas a partir de un núcleo polivalente, particularmente un núcleo polifenólico o de átomo de silicio, dendrímeros esféricos, o bien se han obtenido como cuñas dendríticas, presentando un punto de crecimiento conocido como punto focal. La funcionalización de la periferia de estos dendrímeros se realiza por reacción tiol-eno o tiol-ino entre un tiol que contiene el grupo aniónico o catiónico, o su precursor correspondiente, y un dendrímero funcionalizado con olefinas o alquinos terminales. Además, la invención se refiere a su procedimiento de obtención y sus usos en biomedicina.

COMPUESTOS DENDRÍTICOS CARBOSILANOS HOMO Y HETERO-FUNCIONALIZADOS.

La presente invención se refiere a compuestos dendríticos, particularmente dendrímeros o dendrones,

de estructura carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos funcionales que preferiblemente están en forma aniónica o catiónica. La presente invención también se refiere a su procedimiento de obtención llevado a cabo por reacción tiol-eno o tiol-ino. Además, la invención se refiere a los usos de dichos compuestos en biomedicina.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los dendrímeros son moléculas hiperramificadas de construcción arborescente, de tamaño y estructura tridimensional bien definidos y que poseen unas propiedades químicas uniformes debidas en parte a su baja polidispersidad. Es bastante reciente el descubrimiento de que los dendrímeros por sí mismos pueden tener una actividad biológica, actuando así por ejemplo como agentes antibacterianos o antivirales. También pueden actuar como agentes de transporte de ácidos nucleicos o fármacos.

Los dendrímeros descritos en la bibliografía y potencialmente útiles como agentes antivirales pueden presentar distintos tipos de esqueletos, pero en lo que se refiere a los grupos funcionales que presentan en su periferia, que son los verdaderos responsables de su actividad antiviral, pueden ser agrupados en tres tipos: carbohidratos, péptidos y aniones.

Por otro lado, se han descrito dendrímeros de estructura carbosilano de naturaleza catiónica que se han mostrado útiles para aplicaciones en biomedicina (N. Weber, P. Ortega, M. I. Clemente, D. 25 Shcharbin, M. Br y szewska, F. J. de la Mata, R. Gómez, M. A.Muñoz-Fernandez. J. of Controlled Released. 2008, 132, 55-64) . Estos derivados no son tóxicos en un rango de concentraciones entre 1 y 5 µM y son capaces de interaccionar de forma electrostática con material nucleico como oligonucleótidos o pequeños ARN de interferencia (siRNA) formando bioconjugados denominados “dendriplexes”. Estos “dendriplexes” han mostrado también una baja toxicidad, capacidad para proteger

al material nucleico del ataque de las proteínas del suero y de las nucleasas y son capaces de transportar este material hasta el interior de las células, por lo que se pueden considerar como vectores no virales para la transfección de material nucleico al interior de varios tipos de líneas celulares en procesos de terapia génica.

También, los dendrímeros carbosilano catiónicos han mostrado actividad antimicrobiana tanto frente a bacterias Gram positivas como frente a bacterias Gram negativas. Esta actividad parece estar relacionada con la multivalencia que presentan los dendrímeros, que permite la presencia de un número elevado de funcionalidades sobre una misma molécula. Así, dendrímeros carbosilano con grupos amonio terminales de primera, segunda o tercera generación se han mostrado eficaces como biocidas multivalentes, mostrando una actividad antibacteriana que es más de dos órdenes de magnitud mayor que la de los compuestos análogos monofuncionales (Beatriz Rasines, Jose Manuel Hernández-Ros, Natividad de las Cuevas, Jose Luis Copa-Patiño, Juan Soliveri, María Angeles Muñoz-Fernández, Rafael Gómez, F. Javier de la Mata. Dalton Transactions, 2009, 40, 8704-8713; ES2265291) .

La eficacia mostrada por los dendrímeros carbosilano tanto aniónicos como catiónicos en diferentes campos de la biomedicina hace necesario el encontrar un método fácil y versátil que permita la obtención de estos derivados en un proceso de elevado rendimiento a partir de reactivos fácilmente accesibles y mediante reacciones químicas cuantitativas que toleren una gran variedad de condiciones de reacción.

Los dendrímeros carbosilano se construyen por repetición de reacciones de hidrosililación con derivados del tipo HSiMexCl (3-x) y posterior alquenilación, generando de este modo dendrímeros funcionalizados con olefinas terminales. Una vez alcanzada la generación deseada se lleva a cabo una reacción de hidrosililación con HSiMe2Cl y posterior sustitución del sistema Si-Cl por otro del tipo 55 Si-H con LiAlH4, obteniendo de esta manera dendrímeros con grupos Si-H en la periferia. A partir de estos dendrímeros se pueden introducir aminas terminales por reacción de hidrosililación de alilaminas, que por posterior cuaternización permite obtener dendrímeros catiónicos. Por otra parte, los dendrímeros carbosilano neutros con grupos -NHR obtenidos de esta manera se han empleado para obtener dendrímeros aniónicos carboxilato por reacción con acrilato de metilo y posterior

tratamiento básico y dendrímeros aniónicos sulfonato por reacción con vinilsulfonato (WO2011/101520 A2) .

Este procedimiento sintético resulta largo con el consiguiente encarecimiento del proceso y disminución del rendimiento global para la obtención del dendrímero deseado. Además, la hidrosililación de C3H5NH2 necesaria para luego obtener dendrímeros aniónicos requiere calentar a 120ºC durante más de dos días, disminuyendo el rendimiento de manera notable para generaciones superiores. También la introducción de alguno de los grupos funcionales terminales, como los grupos sulfonato, necesitan temperaturas elevadas y tiempos de reacción largos.

Teniendo en cuenta lo anterior, la simplificación del procedimiento para obtener dendrímeros tanto catiónicos como aniónicos sería de gran importancia, reduciendo costes y facilitando el acceso a moléculas con potencial biomédico.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona macromoléculas altamente ramificadas, dendrímeros o dendrones, de estructura carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos aniónicos (como carboxilato, sulfonato o sulfatos) , que dotan a la macromolécula de una carga neta negativa, o catiónicos (amonio) , que dotan al dendrímero de una carga positiva neta. En concreto los dendrímeros presentan un núcleo preferentemente polifenólico o de átomo de silicio. El procedimiento de obtención de los compuestos de la invención permite, mediante un proceso sencillo, la versatilidad en la síntesis de dendrímeros o dendrones, de naturaleza catiónica o aniónica, y además la posibilidad de sintetizar dendrímeros o dendrones heterofuncionalizados, que consisten en las moléculas anteriores pero con una o varias de sus ramas sustituidas por grupos diferentes, como pueden ser grupos cromóforos. Además la invención proporciona sus usos en biomedicina.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto dendrítico carbosilano (a partir de ahora compuesto de la invención) que comprende: -una capa externa, que consiste, total o parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula (I) :

(I)

donde: R2 es un grupo alquilo (C1-C4) , preferiblemente R2 es un grupo metilo; p es un número entero y varía entre 1 y 3, preferiblemente p es 2; y R1 es el siguiente grupo - (CH2) x-S- (CH2) y-R3;

x representa un número entero que varía de 2 a 5; preferiblemente x es 2ó 3; y representa un número entero que varía de 1 a 10; preferiblemente y varia entre 1 y 5; R3 es un grupo –OH, –SO3H, -OSO3H, -COOR’ o –NR’’R’’’, donde R’, R’’ y R’’’, representan de 40 manera independiente un grupo alquilo (C1-C4) o un hidrógeno;

o cualquiera de sus sales.

Cuando R3 es –NR’’R’’’, preferiblemente R’’ y R’’’, representan de manera independiente un grupo alquilo (C1-C4) o hidrógeno, más preferiblemente un grupo alquilo (C1-C2) o hidrógeno, aún más 45 preferiblemente R3 es un grupo -N (CH3) 2. Aún más preferiblemente x es 2 y aún más preferiblemente y es 2. En una realización más preferida, cuando R3 es –NR’’R’’’, R1 es el grupo - (CH2) 2-S- (CH2) 2N (CH3) 2.

Cuando R3 es un grupo –CO2R’, preferiblemente R’ es H o CH3, más preferiblemente x es 2 ó 3, y aún 50 más preferiblemente y es 1 ó 2.

Cuando R3 es un grupo -SO3H o -OSO3H, preferiblemente x es 2 ó 3, y más preferiblemente y es 2 ó 3.

El término “alquilo” se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que 55 tienen de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo o sec-butilo, preferiblemente tiene de 1 a 2 átomos de carbono, más preferiblemente el grupo alquilo es un metilo.

Por “compuesto dendrítico” se refiere en la presente invención a una macromolécula muy ramificada donde las unidades, ramas... [Seguir leyendo]

1. Compuesto dendrítico carbosilano que comprende:

-una capa externa, que consiste, total o parcialmente, en unidades iguales o diferentes del grupo de fórmula (I) :

(I)

donde:R2 es un grupo alquilo (C1-C4) , p es un número entero y varía entre 1 y 3, y R1 es el siguiente grupo - (CH2) x-S- (CH2) y-R3; x representa un número entero que varía de 2 a 5; y representa un número entero que varía de 1 a 10; y

R3 es un grupo –OH, –SO3H, -OSO3H, -COOR’, -NR’’R’’’, donde R’, R’’ y R’’’, representan de manera independiente un grupo alquilo (C1-C4) o un hidrógeno;

o cualquiera de sus sales.

2. Compuesto según la reivindicación anterior, donde p es 2. 20

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R2 es un grupo metilo.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde x es 2 ó 3.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde R3 es un grupo -N (CH3) 2.

6. Compuesto según la reivindicación anterior, donde y es 2.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R3 es un grupo –CO2H o 30 CO2Me.

8. Compuesto según la reivindicación anterior, donde y es 1 ó 2.

9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R3 es un grupo -SO3H o 35 OSO3H.

10. Compuesto según según la reivindicación anterior, donde y es 2 ó 3.

11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde en la capa externa además

comprende un grupo R1 donde al menos uno de los grupos R3 es un grupo R3 diferente al resto de grupos R3 que forman la capa externa del compuesto dendrítico, un grupo –NHR5 o un grupo –R5, y donde dicho R5 es un grupo director, una molécula etiqueta, preferiblemente un fluoróforo, o un principio activo.

12. Compuesto según la reivindicación anterior, donde R5 es un fluoróforo que se selecciona de lista que comprende fluoresceína, rodamina y dansilo.

13. Compuesto según la reivindicación anterior, donde dicho compuesto es un dendrímero o una cuña dendrítica. 50

14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho compuesto es un dendrímero que comprende un núcleo polifuncional seleccionado entre un grupo sililo o un polifenol.

15. Compuesto según la reivindicación anterior, donde el polifenol es 1, 3, 5-trihidroxibenceno.

16. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde dicho compuesto es una cuña dendrítica con un punto focal seleccionado del grupo – (CH2) z-R4; donde z es un número entero que varía de 1 a 10 y R4 es grupo seleccionado de la lista que comprende –OH, -SH, Br, -COOR4’’’,

NR4’R4’’, ftalimida, -N3, -O-CH2-CCH, -O-CCH, –NHR5, R5, -SCOCH3 o – p-O-C6H4- (CH2) x’-OH donde R4’ y R4’’ representan de manera independiente un grupo alquilo (C1-C4) o un hidrógeno, x’ es un valor entero que varia de entre 1 a 4 y R5 esta descrito en cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12.

17. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho compuesto es catiónico, cuando R3 es un grupo amino, o aniónico para el resto de grupos R3 descritos en la reivindicación 1.

18. Compuestos según la reivindicación anterior, donde dicho compuesto está en forma de sal.

19. Procedimiento de obtención de los compuestos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende una reacción tiol-eno o tiol-ino, entre un precursor de dicho compuesto con olefinas o alquinos terminales, respectivamente, y el grupo tiol SH- (CH2) y-R3, donde R3 e y están descritos en la reivindicación 1.

20. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde dicha reacción se lleva a cabo en presencia de un disolvente polar y preferiblemente en presencia de un fotoiniciador.

21. Uso de los compuestos catiónicos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, como vector no viral.

22. Uso según la reivindicación anterior, donde el vector no viral es empleado para la transfección o internalización de material nucleico en procesos de terapia génica. 25

23. Uso según la reivindicación anterior, donde el material nucleico se selecciona entre oligonucleotidos, siRNA o ADN.

24. Uso de los compuestos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para la 30 elaboración de un medicamento.

25. Uso de los compuestos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades causadas por un microorganismo.

26. Uso según la reivindicación anterior, donde la enfermedad es causada por el VIH.

27. Uso de los compuestos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para la

elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de leishmaniasis. 40

28. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

29. Composición farmacéutica que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o 45 otro principio activo, preferiblemente un antibiótico, antiinflamatorio o antiviral.

30. Vector no viral que comprende al menos un compuesto catiónico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

31. Vector según la reivindicación anterior, que además comprende material nucleico.

32. Vector según la reivindicación anterior, donde el material nucleico se selecciona de entre oligonucleotidos, siRNA o ADN.

33. Uso del vector no viral según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, para la elaboración de un medicamento.

34. Uso del vector no viral según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la infección por VIH o del cáncer en terapia génica. 60

35. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, como vehículo de transporte de moléculas.

36. Uso según la reivindicación anterior, donde la molécula es aniónica o catiónica.

37. Uso según la reivindicación anterior, donde la molécula es un fármaco, preferiblemente un antibiótico.

38. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, como agente biocida.

Fig. 1B Fig. 2A

horas

siR

1:1 1:2 1:4 1:8 1:12

B

1:1 1:2 1:4 1:8 1:12 B NA

D

D

Dendriplex Dendriplex E

E

F

F

32

12

Fig. 2B

horas siR

1:1 1:2 1:4 1:8 1:12

B

1:1 1:2 1:4 1:8 1:12 B NA

D D

Dendriplex Dendriplex E

E

F F

32

12

Fig. 2C

horas siR 1:1 1:2 1:4 1:8 1:12 B 1:1 1:2 1:4 1:8 1:12 B NA DD

Dendriplex E Dendriplex E

FF

34

34

Fig. 2D

horas siR 1:1 1:2 1:4 1:8 1:12 B 1:1 1:2 1:4 1:8 1:12 B NA DD

Dendriplex E Dendriplex E

FF

34

34

Fig. 4A

horas 16 horas siRNA siRNA + + + +++

++ + +++

BEDF31 1/12 BEDF31 1/12 -+ + + + +

-+++++ Heparina Heparina --+ + + +

--++++ 0, 1 0, 2 0, 3 0, 6 0, 1 0, 2 0, 3 0, 6

Fig. 4B

horas 16 horas siRNA siRNA

+ +++++ + +++++ BEDF32 1/12 BEDF32 1/12

-+++++ -+++++ Heparina Heparina

--++++ --++++ 0, 1 0, 2 0, 3 0, 6 0, 1 0, 2 0, 3 0, 6

Fig. 4C

2 horas 16 horas

siRNA BEDF33 1/8 Heparina + -- + + - 0, 1 + + + 0, 2 + + + 0, 3 + + + 0, 6 + + + siRNA BEDF33 1/8 Heparina + -- + + - + + + 0, 1 + + + 0, 2 + + + 0, 3 + + + 0, 6

Fig. 4D

horas 16 horas siRNA siRNA

+++ +++ +++ +++ BEDF34 1/8 BEDF34 1/8

-++ +++ -++ +++ Heparina Heparina

--+ +++ --+ +++ 0, 1 0, 2 0, 3 0, 6

0, 1 0, 2 0, 3 0, 6

% Infeccion PBMCs

Fig. 5

Ensayo de inhibicion VIH postratamiento

Fig. 6 Fig. 7A

Mock DMSO Dxt 0, 1 1 10 100 1000

BDMG017 [ M]

Fig. 7B

Mock DMSO Dxt 0, 1 1 10 100 1000

BDMG018 [ M]

Fig. 8A

HEC-1A

Fig.8B

HEC-1A

NL4.3 AMD3100 T20 10 M 100 M BDMG017

% Entrada Agp24

BDMG018

D

BaL

BaL

Fig.8C

HEC-1A

Mvc T20

Fig. 8D

HEC-1A

Mvc T20

% Entrada Agp24

% Entrada Agp24

M 100 M BDMG017

***

***

M 100 M BDMG018

%Producción Agp24

Fig. 9A

NL4.3 Prett NL4.3 Postt

*** ** ***

Ct AMD T20 Sur 10 M 100 M BDMG017, [ M]

Fig.9B

50

BaL Prett BaL Postt

*** *

***

Ct TAK T20 Mvc 10 M 100 M BDMG017, [ M]

%Producción Agp24

%Producción Agp24

%Producción Agp24