Células, líneas celulares y modelo animal no humano, para la determinación de agentes terapéuticos.

Células, líneas celulares y modelo animal no humano, para la determinación de agentes terapéuticos.

La presente invención describe células madre mesenquimales aisladas diferenciadas a progenitor osteogénico, modificadas genéticamente mediante la deleción de las secuencias o de un fragmento de las secuencias que codifican para la proteína p53 y la proteína Rb. Las células descritas en la presente invención tienen además la capacidad de originar tumores in vivo del tipo osteosarcoma. En la presente invención se describen también las líneas y poblaciones celulares, así como un modelo animal no humano al que se le han implantado dichas células madre osteosarcoma-like. Del mismo modo, la presente invención describe el método de obtención de dichas células y usos, preferentemente para el screening de agentes útiles en el tratamiento y/o prevención del sarcoma.

Células, líneas celulares y modelo animal no humano, para la determinación de agentes terapéuticos.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y la biotecnología, y se refiere a células madre mesenquimales procedentes de médula ósea diferenciadas a progenitores osteogénicos y modificadas genéticamente de manera que promueven tumores in vivo del tipo osteosarcoma, a las líneas celulares y, también, a un modelo animal no humano al que se le ha implantado dichas células madre osteosarcoma-like, para el screening de agentes útiles en el tratamiento y/o prevención del sarcoma, y preferentemente del osteosarcoma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las células madre/estromales mesenquimales multipotentes (mesenchymal stromal/stem cells ó MSCs) representan una población de células poco frecuentes presente en muchos tejidos que constituyen una fuente de progenitores mesodérmicos (García-Castro J. et al., 2008. J Cell Mol Med. 12; 6; 2552-2565) . La evidencia creciente sugiere que las MSCs pueden ser las células de origen o células iniciadoras de tumores capaces de iniciar sarcomagénesis, y varios tipos de sarcomas se han modelado mediante la inducción de la transformación de las MSCs con diferentes eventos oncogénicos (Rodriguez et al., Cell Res 2012; 22:62-77) . Los sarcomas son un grupo heterogéneo de tumores malignos de origen mesenquimal que se han agrupado históricamente como sarcomas de tejidos blandos (STS) y los sarcomas óseos primarios. Los sarcomas son generalmente estudiados una vez que los eventos de transformación ya se han producido y por lo tanto, los mecanismos de transformación no son susceptibles de análisis con muestras de los pacientes, destacando la necesidad de establecer bona fide modelos experimentales para recapitular la sarcomagénesis. El desarrollo de los modelos in vivo para distintos sarcomas es probable que constituyan un sistema sin precedentes para el ensayo de tratamientos específicos que sean más dirigidos y menos técnicos.

El fallo en la regulación del ciclo celular se asocia a menudo con el desarrollo del sarcoma. De hecho, las alteraciones en los genes Rb y p53 son las mutaciones más comunes que se encuentran en los sarcomas caracterizados por cariotipos complejos como el osteosarcoma y el leiomiosarcoma (Helman y Meltzer, Nat Rev Cancer. 2003; 3: 685-694) . Por otra parte, el síndrome de Li-Fraumeni, que es causado por mutaciones de p53

en la línea germinal y los pacientes con mutaciones en la línea germinal Rb, muestran una mayor frecuencia tanto de osteosarcomas como de STS (Helman y Meltzer, Nat Rev Cancer. 2003; 3: 685-694; Malkin, Science, 1990; 250: 1233-1238) . Además, la inactivación del control del ciclo celular y la acumulación de inestabilidad genómica se han asociado con la transformación espontánea de las MSCs de ratón. Así mismo, genetic targeting de p53 en mMSCs desencadena un programa de transformación de las mMSCs.

p53 y Rb son reguladores clave de la homeostasis celular que controla el ciclo celular, la apoptosis, la senescencia, la proliferación y la diferenciación. En cuanto a la diferenciación mesenquimal, la activación de p53 suprime la diferenciación de los osteoblastos mediante la inhibición de la expresión de Runx2. Por el contrario, la supresión de p53 acelera la diferenciación osteoblástica, aunque dificulta la maduración terminal de los osteocitos. Además de la diferenciación osteoblástica, p53 también inhibe los programas adipogénicos y de diferenciación del músculo liso, regulando a la baja PPAR y MYOCD, respectivamente (Molchadsky, PLoS ONE, 2008; 3: e3707) . Por otro lado, se ha visto que Rb regula la diferenciación mesenquimal lo largo de diferentes linajes mesenquimales, incluyendo osteoblástica, adipogénica y miogénica, a través de la regulación de la transcripción de varios factores de transcripción específicos del linaje (Thomas et al., Mol Cell. 2001; 8: 303-31;

Calo et al., Nature 2010; 466: 1110-1114. Gutierrez et al., Natl Acad Sci U S A. 2008; 105: 18402-18407; De Falco et al., Oncogene. 2006; 25: 5244-5249) . Por ejemplo, la deficiencia de Rb parece afectar el desarrollo óseo a favor de la diferenciación adipogénica (Calo et al., Nature 2010; 466: 1110-1114. Gutiérrez et al., Natl Acad Sci U S A. 2008; 105: 18402-18407) .

Los modelos de ratón que muestran la inactivación específica de p53 sóla o en combinación con Rb en el linaje osteoblástico a través de la expresión de Cre dirigida por Oxterix desarrollaron osteoarcoma (Berman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105: 11851-11856; Walkley et al., Genes Dev. 2008; 22: 1662-1676) . Asimismo, otro modelo de ratón en el que se inactivaron p53 y Rb en los tejidos mesenquimales tempranos de las extremidades embrionarias también resultó en el desarrollo del sarcoma, principalmente de osteosarcoma, aunque la supresión 55 concomitante de Rb condujo a un incremento en la prevalencia de STS indiferenciados (Lin et al., Carcinogenesis, 2009 30: 1789-1795) . En contraste con estos trabajos que relacionan la deficiencia de p53 y Rb con el desarrollo de osteosarcoma, se ha informado anteriormente de que MSCs p53-/-y p53-/-Rb-/- derivadas de tejido adiposo de (ASCs) dan lugar a tumores como el leiomiosarcoma (leiomyosarcoma-like) , en ratones immunedeficientes, y en ningún caso se observaron las características histopatológicas de osteosarcoma.

Por tanto, se hace necesaria la generación y el establecimiento de líneas celulares que permitan el desarrollo de modelos de osteosarcoma ajustados al modelo jerárquico del cáncer para estudiar la patogénesis y abordar la identificación de fármacos específicos dirigidos contra las células iniciadoras del sarcoma.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la invención proponen que hay dos factores principales previamente no explorados que potencialmente influyen en el fenotipo del sarcoma, explicando al menos en parte, las controversias entre los 5 estudios anteriores:

(i) el distinto tejido fuente de la MSCs transformada, y

(ii) el diferente estado de diferenciación a lo largo de un linaje particular.

Con el fin de abordar estas dos cuestiones, los inventores obtuvieron MSCs a partir de tejido adiposo (ASCs) y de la médula ósea (BM-MSCs) de ratones p53loxP/loxP, de ratones RbloxP/loxP, o del doble p53loxP/loxP RbloxP/loxP y después de la deleción mediada por Cre se comparó el potencial tumorogénico de:

(i) ASCs indiferenciadas p53-/-y Rb-/-p53-/-frente a los mismos genotipos de BM-MSC indiferenciadas, y

(ii) BM-MSCs Rb-/-p53-/-indiferenciadas frente a progenitores osteogénicos derivados de BM-MSCs a los que se les ha delecionado Rb-/-p53-/-. (los progenitores osteogénicos ya provienen de BM-MSCs Rb-/-p53-/-) .

Los autores demuestran que tanto las BM-MSCs p53-/-como las Rb-/-p53-/-indiferenciadas inician la formación de leiomiosarcoma idénticos a los resultados con ASCs p53-/-y Rb-/-p53-/-, lo que indica que la fuente del tejido de las MSCs no parece determinar el fenotipo de desarrollo del sarcoma in vivo. Sin embargo, los progenitores osteogénicos Rb-/-p53-/-diferenciados de BM-MSCs desarrollaron tumores osteosarcoma-like cuando se inocularon en ratones inmunodeficientes, lo que sugiere que el estadio de diferenciación de las MSCs Rb-/-p53-/impone el fenotipo de los sarcomas desarrollados in vivo y que los progenitores osteogénicos, más que MSCs indiferenciadas, parecen ser la célula de origen para el desarrollo del osteosarcoma.

Los autores de la presente invención han desarrollado un procedimiento para generar nuevas células primarias generadoras de osteosarcoma, que se ajustan al modelo jerárquico del cáncer, así como un modelo animal subcutáneamente trasplantado con dichas células.

CÉLULAS, LÍNEAS CELULARES Y MÉTODO DE OBTENCIÓN

Un primer aspecto de la invención se refiere a una célula madre mesenquimal aislada (MSC) , de ahora en adelante célula de la invención, diferenciada a progenitor osteogénico, modificada genéticamente y con capacidad de originar un osteosarcoma, que comprende la deleción de la secuencia o de un fragmento de la secuencia que codifica la proteína p53. En una realización preferida la célula madre se ha obtenido de médula ósea.

En otra realización preferente de este aspecto de la invención, la secuencia o el fragmento de la secuencia delecionada que codifica a la proteína p53 es la SEQ ID NO: 1, o cualquiera de sus variantes o fragmentos biológicamente activos. En otra realización más preferida, la célula además comprende la deleción de la secuencia que codifica para la proteína Retinoblastoma (Rb) . En una realización aún mucho más preferente, la secuencia delecionada que... [Seguir leyendo]

1. Una célula madre mesenquimal aislada, procedente de médula ósea, diferenciada a progenitor osteogénico, modificada genéticamente y con capacidad de originar un osteosarcoma, que comprende la deleción de las 5 secuencias o de un fragmento de las secuencias que codifican la proteína p53 y la proteína Rb.

2. La célula madre mesenquimal aislada según la reivindicación anterior, donde la secuencia delecionada que codifica a la proteína p53 es la SEQ ID NO: 1, o cualquiera de sus variantes o fragmentos biológicamente activos.

3. La célula madre mesenquimal aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la secuencia delecionada que codifica a la proteína Rb es la SEQ ID NO: 3, o cualquiera de sus variantes o fragmentos biológicamente activos.

4. La célula madre mesenquimal aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la célula madre ha sido aislada de un mamífero.

5. Una línea celular derivada de una célula aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Una población celular que comprende al menos una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

7. La población celular según la reivindicación anterior que comprende, al menos, un 90% de células según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

8. Una composición que comprende al menos una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, una línea celular según la reivindicación 5, o una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 6-7.

9. Una composición según la reivindicación 8, que es una composición farmacéutica.

10. Un mamífero no humano que comprende al menos una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, una línea celular según la reivindicación 5, una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8-9.

11. El mamífero no humano según la reivindicación anterior, donde la célula, la línea celular, la población celular 35 o la composición han sido implantadas subcutáneamente.

12. El mamífero no humano según cualquiera de las reivindicaciones 10-11, donde el mamífero es un ratón.

13. El mamífero no humano según la reivindicación anterior, que es un ratón NOD/SCID IL2Rγ-/-.

14. El uso de al menos una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, una línea celular según la reivindicación 5, una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, o un modelo animal según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, para la detección de agentes potencialmente útiles en el tratamiento o prevención del sarcoma.

4.

15. El uso de al menos una célula, la línea celular, la población celular, la composición o el modelo animal según la reivindicación anterior, donde el sarcoma es un osteosarcoma.

16. Un método de detección de agentes potencialmente útiles en el tratamiento o prevención del sarcoma que comprende:

a) poner en contacto o administrar el agente a testar a una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, una línea celular según la reivindicación 5, una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, o un modelo animal según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, y

b) determinar si el agente a testar inhibe la capacidad proliferativa y oncogénica de las células tumorales.

17. El método según la reivindicación anterior, donde el sarcoma es un osteosarcoma.

18. Un kit o dispositivo que comprende al menos una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, una línea celular según la reivindicación 5, una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8-9.

19. El uso del kit según la reivindicación anterior, para la detección de agentes potencialmente útiles en el tratamiento o prevención del sarcoma.

6.

20. El uso del kit según la reivindicación anterior, para la detección de agentes potencialmente útiles en el tratamiento o prevención del osteosarcoma.

21. Un método de obtención de progenitores osteogénicos con capacidad de originar un osteosarcoma, que 5 comprende: a) cultivar células madre mesenquimales procedentes de médula ósea en un medio de diferenciación osteogénica hasta obtener un progenitor osteogénico, y b) delecionar la secuencia que codifica la proteína p53 y la secuencia que codifica la proteína Rb de un progenitor osteogénico de (a) .

1.

22. El método de obtención de progenitores osteogénicos con capacidad de originar un osteosarcoma según la reivindicación anterior, donde la secuencia delecionada que codifica a la proteína p53 es la SEQ ID NO: 1, o cualquiera de sus variantes o fragmentos biológicamente activos.

23. El método de obtención de progenitores osteogénicos con capacidad de originar un osteosarcoma según cualquiera de las reivindicacione.

2. 22, donde la secuencia delecionada que codifica a la proteína Rb es la SEQ ID NO: 3, o cualquiera de sus variantes o fragmentos biológicamente activos.

24. El método de obtención de progenitores osteogénicos con capacidad de originar un osteosarcoma según cualquiera de las reivindicacione.

2. 23, que además comprende: c) implantar un progenitor osteogénico obtenible por el método de cualquiera de las reivindicaciones 2123, en un mamífero no humano según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, para inducir un tumor primario, d) disgregar mecánicamente el tumor primario de (c) , y

e) cultivar el tumor primario en medios de cultivo de MSCs para establecer líneas celulares inmortalizadas.

25. Progenitor osteogénico con capacidad de originar un osteosarcoma obtenible por un método según cualquiera de las reivindicacione.

2. 23. 3.

26. Línea celular inmortalizada obtenible por un método según cualquiera de las reivindicacione.

2. 24.

A

Fig 4S Fig 4S (cont)

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Fundación Pública Andaluza Progreso y Salud

<120> Células, líneas celulares y modelo animal no humano, para ladeterminación de agentes terapéuticos <130> P-05619

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2588

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 1 gatgggattg gggttttccc ctcccatgtg ctcaagactg gcgctaaaag ttttgagctt 60 ctcaaaagtc tagagccacc gtccagggag caggtagctg ctgggctccg gggacacttt 120 gcgttcgggc tgggagcgtg ctttccacga cggtgacacg cttccctgga ttggccagac 180 tgccttccgg gtcactgcca tggaggagcc gcagtcagat cctagcgtcg agccccctct 240 gagtcaggaa acattttcag acctatggaa actacttcct gaaaacaacg ttctgtcccc 300 cttgccgtcc caagcaatgg atgatttgat gctgtccccg gacgatattg aacaatggtt 360 cactgaagac ccaggtccag atgaagctcc cagaatgcca gaggctgctc cccccgtggc 420 ccctgcacca gcagctccta caccggcggc ccctgcacca gccccctcct ggcccctgtc 480 atcttctgtc ccttcccaga aaacctacca gggcagctac ggtttccgtc tgggcttctt 540 gcattctggg acagccaagt ctgtgacttg cacgtactcc cctgccctca acaagatgtt 600 ttgccaactg gccaagacct gccctgtgca gctgtgggtt gattccacac ccccgcccgg 660 cacccgcgtc cgcgccatgg ccatctacaa gcagtcacag cacatgacgg aggttgtgag 720 gcgctgcccc caccatgagc gctgctcaga tagcgatggt ctggcccctc ctcagcatct 780 tatccgagtg gaaggaaatt tgcgtgtgga gtatttggat gacagaaaca cttttcgaca 840 tagtgtggtg gtgccctatg agccgcctga ggttggctct gactgtacca ccatccacta 900 caactacatg tgtaacagtt cctgcatggg cggcatgaac cggaggccca tcctcaccat 960 catcacactg gaagactcca gtggtaatct actgggacgg aacagctttg aggtgcgtgt 1020 ttgtgcctgt cctgggagag accggcgcac agaggaagag aatctccgca agaaagggga 1080 gcctcaccac gagctgcccc cagggagcac taagcgagca ctgcccaaca acaccagctc 1140 ctctccccag ccaaagaaga aaccactgga tggagaatat ttcacccttc agatccgtgg 1200

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<210> 2

<211> 393

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 2

Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln1 5 10 15

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu20 25 30

Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp35 40 45

Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro50 55 60

Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro65 70 75 80

Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser85 90 95

Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly100 105 110

Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro115 120 125

Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln130 135 140

Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met145 150 155 160

Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys165 170 175

Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln180 185 190

His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp195 200 205

Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu210 215 220

Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser225 230 235 240

Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr245 250 255

Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val260 265 270

Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn275 280 285

Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr290 295 300

Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys305 310 315 320

Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu325 330 335

Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp340 345 350

Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His355 360 365

Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met370 375 380

Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp385 390

<210> 3

<211> 4772

<212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 3 gctcagttgc cgggcggggg agggcgcgtc cggtttttct caggggacgt tgaaattatt 60

tttgtaacgg gagtcgggag aggacggggc gtgccccgac gtgcgcgcgc gtcgtcctcc 120

ccggcgctcc tccacagctc gctggctccc gccgcggaaa ggcgtcatgc cgcccaaaac 180

cccccgaaaa acggccgcca ccgccgccgc tgccgccgcg gaacccccgg caccgccgcc 240

gccgccccct cctgaggagg acccagagca ggacagcggc ccggaggacc tgcctctcgt 300

caggcttgag tttgaagaaa cagaagaacc tgattttact gcattatgtc agaaattaaa 360 gataccagat catgtcagag agagagcttg gttaacttgg gagaaagttt catctgtgga 420 tggagtattg ggaggttata ttcaaaagaa aaaggaactg tggggaatct gtatctttat 480 tgcagcagtt gacctagatg agatgtcgtt cacttttact gagctacaga aaaacataga 540 aatcagtgtc cataaattct ttaacttact aaaagaaatt gataccagta ccaaagttga 600 taatgctatg tcaagactgt tgaagaagta tgatgtattg tttgcactct tcagcaaatt 660 ggaaaggaca tgtgaactta tatatttgac acaacccagc agttcgatat ctactgaaat 720 aaattctgca ttggtgctaa aagtttcttg gatcacattt ttattagcta aaggggaagt 780 attacaaatg gaagatgatc tggtgatttc atttcagtta atgctatgtg tccttgacta 840 ttttattaaa ctctcacctc ccatgttgct caaagaacca tataaaacag ctgttatacc 900 cattaatggt tcacctcgaa cacccaggcg aggtcagaac aggagtgcac ggatagcaaa 960 acaactagaa aatgatacaa gaattattga agttctctgt aaagaacatg aatgtaatat 1020 agatgaggtg aaaaatgttt atttcaaaaa ttttatacct tttatgaatt ctcttggact 1080 tgtaacatct aatggacttc cagaggttga aaatctttct aaacgatacg aagaaattta 1140 tcttaaaaat aaagatctag atgcaagatt atttttggat catgataaaa ctcttcagac 1200 tgattctata gacagttttg aaacacagag aacaccacga aaaagtaacc ttgatgaaga 1260 ggtgaatgta attcctccac acactccagt taggactgtt atgaacacta tccaacaatt 1320 aatgatgatt ttaaattcag caagtgatca accttcagaa aatctgattt cctattttaa 1380 caactgcaca gtgaatccaa aagaaagtat actgaaaaga gtgaaggata taggatacat 1440 ctttaaagag aaatttgcta aagctgtggg acagggttgt gtcgaaattg gatcacagcg 1500 atacaaactt ggagttcgct tgtattaccg agtaatggaa tccatgctta aatcagaaga 1560 agaacgatta tccattcaaa attttagcaa acttctgaat gacaacattt ttcatatgtc 1620 tttattggcg tgcgctcttg aggttgtaat ggccacatat agcagaagta catctcagaa 1680 tcttgattct ggaacagatt tgtctttccc atggattctg aatgtgctta atttaaaagc 1740 ctttgatttt tacaaagtga tcgaaagttt tatcaaagca gaaggcaact tgacaagaga 1800 aatgataaaa catttagaac gatgtgaaca tcgaatcatg gaatcccttg catggctctc 1860 agattcacct ttatttgatc ttattaaaca atcaaaggac cgagaaggac caactgatca 1920 ccttgaatct gcttgtcctc ttaatcttcc tctccagaat aatcacactg cagcagatat 1980 gtatctttct cctgtaagat ctccaaagaa aaaaggttca actacgcgtg taaattctac 2040

tgcaaatgca gagacacaag caacctcagc cttccagacc cagaagccat tgaaatctac 2100 ctctctttca ctgttttata aaaaagtgta tcggctagcc tatctccggc taaatacact 2160 ttgtgaacgc cttctgtctg agcacccaga attagaacat atcatctgga cccttttcca 2220 gcacaccctg cagaatgagt atgaactcat gagagacagg catttggacc aaattatgat 2280 gtgttccatg tatggcatat gcaaagtgaa gaatatagac cttaaattca aaatcattgt 2340 aacagcatac aaggatcttc ctcatgctgt tcaggagaca ttcaaacgtg ttttgatcaa 2400 agaagaggag tatgattcta ttatagtatt ctataactcg gtcttcatgc agagactgaa 2460 aacaaatatt ttgcagtatg cttccaccag gccccctacc ttgtcaccaa tacctcacat 2520 tcctcgaagc ccttacaagt ttcctagttc acccttacgg attcctggag ggaacatcta 2580 tatttcaccc ctgaagagtc catataaaat ttcagaaggt ctgccaacac caacaaaaat 2640 gactccaaga tcaagaatct tagtatcaat tggtgaatca ttcgggactt ctgagaagtt 2700 ccagaaaata aatcagatgg tatgtaacag cgaccgtgtg ctcaaaagaa gtgctgaagg 2760 aagcaaccct cctaaaccac tgaaaaaact acgctttgat attgaaggat cagatgaagc 2820 agatggaagt aaacatctcc caggagagtc caaatttcag cagaaactgg cagaaatgac 2880 ttctactcga acacgaatgc aaaagcagaa aatgaatgat agcatggata cctcaaacaa 2940 ggaagagaaa tgaggatctc aggaccttgg tggacactgt gtacacctct ggattcattg 3000 tctctcacag atgtgactgt ataactttcc caggttctgt ttatggccac atttaatatc 3060 ttcagctctt tttgtggata taaaatgtgc agatgcaatt gtttgggtga ttcctaagcc 3120 acttgaaatg ttagtcattg ttatttatac aagattgaaa atcttgtgta aatcctgcca 3180 tttaaaaagt tgtagcagat tgtttcctct tccaaagtaa aattgctgtg ctttatggat 3240 agtaagaatg gccctagagt gggagtcctg ataacccagg cctgtctgac tactttgcct 3300 tcttttgtag catataggtg atgtttgctc ttgtttttat taatttatat gtatattttt 3360 ttaatttaac atgaacaccc ttagaaaatg tgtcctatct atcttccaaa tgcaatttga 3420 ttgactgccc attcaccaaa attatcctga actcttctgc aaaaatggat attattagaa 3480 attagaaaaa aattactaat tttacacatt agattttatt ttactattgg aatctgatat 3540 actgtgtgct tgttttataa aattttgctt ttaattaaat aaaagctgga agcaaagtat 3600 aaccatatga tactatcata ctactgaaac agatttcata cctcagaatg taaaagaact 3660 tactgattat tttcttcatc caacttatgt ttttaaatga ggattattga tagtactctt 3720 ggtttttata ccattcagat cactgaattt ataaagtacc catctagtac ttgaaaaagt 3780

aaagtgttct gccagatctt aggtatagag gaccctaaca cagtatatcc caagtgcact 3840 ttctaatgtt tctgggtcct gaagaattaa gatacaaatt aattttactc cataaacaga 3900 ctgttaatta taggagcctt aatttttttt tcatagagat ttgtctaatt gcatctcaaa 3960 attattctgc cctccttaat ttgggaaggt ttgtgttttc tctggaatgg tacatgtctt 4020 ccatgtatct tttgaactgg caattgtcta tttatctttt atttttttaa gtcagtatgg 4080 tctaacactg gcatgttcaa agccacatta tttctagtcc aaaattacaa gtaatcaagg 4140 gtcattatgg gttaggcatt aatgtttcta tctgattttg tgcaaaagct tcaaattaaa 4200 acagctgcat tagaaaaaga ggcgcttctc ccctccccta cacctaaagg tgtatttaaa 4260 ctatcttgtg tgattaactt atttagagat gctgtaactt aaaatagggg atatttaagg 4320 tagcttcagc tagcttttag gaaaatcact ttgtctaact cagaattatt tttaaaaaga 4380 aatctggtct tgttagaaaa caaaatttta ttttgtgctc atttaagttt caaacttact 4440 attttgacag ttattttgat aacaatgaca ctagaaaact tgactccatt tcatcattgt 4500 ttctgcatga atatcataca aatcagttag tttttaggtc aagggcttac tatttctggg 4560 tcttttgcta ctaagttcac attagaatta gtgccagaat tttaggaact tcagagatcg 4620 tgtattgaga tttcttaaat aatgcttcag atattattgc tttattgctt ttttgtattg 4680 gttaaaactg tacatttaaa attgctatgt tactattttc tacaattaat agtttgtcta 4740 ttttaaaata aattagttgt taagagtctt aa 4772

<210> 4

<211> 928

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 4

Met Pro Pro Lys Thr Pro Arg Lys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala1 5 10 15

Ala Ala Glu Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Glu Glu Asp20 25 30

Pro Glu Gln Asp Ser Gly Pro Glu Asp Leu Pro Leu Val Arg Leu Glu35 40 45

Phe Glu Glu Thr Glu Glu Pro Asp Phe Thr Ala Leu Cys Gln Lys Leu50 55 60

Lys Ile Pro Asp His Val Arg Glu Arg Ala Trp Leu Thr Trp Glu Lys65 70 75 80

Val Ser Ser Val Asp Gly Val Leu Gly Gly Tyr Ile Gln Lys Lys Lys85 90 95

Glu Leu Trp Gly Ile Cys Ile Phe Ile Ala Ala Val Asp Leu Asp Glu100 105 110

Met Ser Phe Thr Phe Thr Glu Leu Gln Lys Asn Ile Glu Ile Ser Val115 120 125

His Lys Phe Phe Asn Leu Leu Lys Glu Ile Asp Thr Ser Thr Lys Val130 135 140

Asp Asn Ala Met Ser Arg Leu Leu Lys Lys Tyr Asp Val Leu Phe Ala145 150 155 160

Leu Phe Ser Lys Leu Glu Arg Thr Cys Glu Leu Ile Tyr Leu Thr Gln165 170 175

Pro Ser Ser Ser Ile Ser Thr Glu Ile Asn Ser Ala Leu Val Leu Lys180 185 190

Val Ser Trp Ile Thr Phe Leu Leu Ala Lys Gly Glu Val Leu Gln Met195 200 205

Glu Asp Asp Leu Val Ile Ser Phe Gln Leu Met Leu Cys Val Leu Asp210 215 220

Tyr Phe Ile Lys Leu Ser Pro Pro Met Leu Leu Lys Glu Pro Tyr Lys225 230 235 240

Thr Ala Val Ile Pro Ile Asn Gly Ser Pro Arg Thr Pro Arg Arg Gly245 250 255

Gln Asn Arg Ser Ala Arg Ile Ala Lys Gln Leu Glu Asn Asp Thr Arg260 265 270

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Lys Asn Val Tyr Phe Lys Asn Phe Ile Pro Phe Met Asn Ser Leu Gly290 295 300

Leu Val Thr Ser Asn Gly Leu Pro Glu Val Glu Asn Leu Ser Lys Arg305 310 315 320

Tyr Glu Glu Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Asp Leu Asp Ala Arg Leu Phe325 330 335

Leu Asp His Asp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Ser Ile Asp Ser Phe Glu340 345 350

Thr Gln Arg Thr Pro Arg Lys Ser Asn Leu Asp Glu Glu Val Asn Val355 360 365

Ile Pro Pro His Thr Pro Val Arg Thr Val Met Asn Thr Ile Gln Gln370 375 380

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Ala Val Gly Gln Gly Cys Val Glu Ile Gly Ser Gln Arg Tyr Lys Leu435 440 445

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Glu Glu Arg Leu Ser Ile Gln Asn Phe Ser Lys Leu Leu Asn Asp Asn465 470 475 480

Ile Phe His Met Ser Leu Leu Ala Cys Ala Leu Glu Val Val Met Ala485 490 495

Thr Tyr Ser Arg Ser Thr Ser Gln Asn Leu Asp Ser Gly Thr Asp Leu500 505 510

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Tyr Lys Val Ile Glu Ser Phe Ile Lys Ala Glu Gly Asn Leu Thr Arg530 535 540

Glu Met Ile Lys His Leu Glu Arg Cys Glu His Arg Ile Met Glu Ser545 550 555 560

Leu Ala Trp Leu Ser Asp Ser Pro Leu Phe Asp Leu Ile Lys Gln Ser565 570 575

Lys Asp Arg Glu Gly Pro Thr Asp His Leu Glu Ser Ala Cys Pro Leu580 585 590

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Phe Lys Ile Ile Val Thr Ala Tyr Lys Asp Leu Pro His Ala Val Gln725 730 735

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Lys Gln Lys Met Asn Asp Ser Met Asp Thr Ser Asn Lys Glu Glu Lys915 920 925