Composición para su uso como agente antifúngico.

Composición para su uso como agente antifúngico.

La presente invención proporciona una composición que comprende quitosano,

o un oligosacárido de quitosano, y un inhibidor del gen ARL1 o fluconazol, la cual es de utilidad para inhibir el crecimiento en células eucariotas. Por tanto, se propone su uso como agente antifúngico y para la prevención y/o tratamiento de infecciones fúngicas.

Composición para su uso como agente antifúngico.

La presente invención se encuadra en el campo de la terapia génica y las composiciones antifúngicas, específicamente dentro de las composiciones basadas en el uso combinado de quitosano, u oligosacáridos del quitosano, con inhibidores capaces de alterar la expresión génica de determinadas dianas moleculares cuya inhibición conduce a una mayor sensibilidad de las células eucariotas a los efectos del quitosano o de sus oligosacáridos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La quitina es un polímero natural abundante que forma el exoesqueleto de los crustáceos, la cutícula de los artrópodos y las paredes celulares de la mayoría de los hongos. El quitosano es un polímero de N-glucosamina obtenido por N-deacetilación parcial de la quitina. La hidrólisis ácida o la rotura enzimática de los enlaces glicosídicos de las cadenas de quitosano, genera cadenas más cortas de un tamaño <1-10 KDa de oligosacáridos de quitosano (COS) . COS tienen mayores propiedades antimicrobianas que el quitosano y actúan como aquél desestabilizando/permeabilizando las membranas celulares de bacterias, levaduras y de otros hongos.

El quitosano ejerce una acción antifúngica en diversos hongos (Palma-Guerrero J., et al., 2010, Appl Microbiol Biot., 87:2237-2245) . Dicho compuesto inhibe tanto el crecimiento de las hifas como la germinación de esporas y reduce la producción de toxinas. Recientemente, se ha demostrado que el quitosano incrementa la producción de conidios en hongos filamentosos, incluso a concentraciones a las que el crecimiento de las hifas esta bloqueado. En conjunto dichas observaciones sugieren que el quitosano ejerce su actividad antifúngica por múltiples mecanismos.

Por otro lado, COS es más soluble y activo biológicamente que el quitosano (Kim SK., Rajapakse N., 2005, Carbohyd Polym., 62:357-368) . La actividad biológica del quitosano y del COS depende de su peso molecular, grado de deacetilación y pH del medio. La actividad antibiótica del quitosano y del COS se debe a la permeabilización de las membranas plasmáticas bacterianas (Liu H., Du Y., Wang X., Sun L., 2004, International journal of food microbiology, 95:147-155) . De igual forma los efectos antifúngicos del quitosano en levaduras y hongos filamentosos son debidos al daño que este compuesto causa a sus membranas plasmáticas. La sensibilidad fúngica al quitosano depende de la fluidez de la membrana. La permeabilización de la membrana plasmática por quitosano también se ha detectado (indirectamente) en Saccharomyces cerevisiae, ya que la deleción de genes codificantes para proteínas implicadas en el mantenimiento de la integridad de la membrana plasmática incrementó la sensibilidad al quitosano en dicho microorganismo (Zakrzewska A., et al., 2007, Eukar y otic cell, 6:600-608) .

Los COS son no-tóxicos para mamíferos, por lo que son de particular interés para su uso como antifúngicos en diversas aplicaciones. No obstante, debido a que muchos de los hongos patógenos pueden desarrollar resistencias al tratamiento prolongado con quitosano o con COS, es deseable mejorar la acción antifúngica del mismo mediante la identificación de dianas moleculares cuya inhibición/activación contribuya a mejorar el efecto de dicho compuesto en la muerte o inhibición del crecimiento de células eucariotas, preferiblemente de hongos. Además, mediante la identificación de dichas dianas moleculares de quitosano o de COS, se consigue incrementar el conocimiento del modo de acción antifúngico de este compuesto.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se ha identificado el gen ARL1, el cual codifica para la proteína Arl1, una GTPasa involucrada en el tráfico de la membrana plasmática, como una diana del quitosano o de los oligosacáridos del quitosano (COS) en células eucariotas.

Como se verá más adelante en los ejemplos, las células eucariotas que presentan deleción homocigótica del gen ARL1 son sensibles a COS. La célula de deleción heterocigótica (arl1Δ) presenta también sensibilidad a COS. Sin embargo, la sobreexpresión del gen ARL1 en células eucariotas confiere resistencia a COS en comparación con las células de tipo salvaje que no son capaces de crecer a la misma concentración del compuesto. Además, dicha sobreexpresión reduce la permeabilización de la membrana plasmática inducida por COS. Este resultado resultó ser dependiente in vivo de la dosis de COS en células eucariotas. Todo ello indica que ARL1 posee un papel importante en el modo de acción de COS como agente antifúngico, ya que la permeabilización de la membrana es la acción principal del quitosano como agente antimicrobiano en hongos y bacterias. Por todo ello, en la presente invención se propone el uso de un inhibidor del gen ARL1 para aumentar la sensibilidad de células eucariotas a quitosano o a sus oligosacáridos.

Además, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante, “composición de la invención”, que comprende quitosano, o un oligosacárido de quitosano, y un inhibidor del gen ARL1.

En la presente invención se entiende por “quitosano” el polisacárido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de 1- (1-4) D-glucosamina (unidades deacetiladas) y de N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilada) obtenido por N-deacetilación parcial de la quitina, y que posee efectos inhibidores del crecimiento de hongos y bacterias.

Un “oligosacárido de quitosano” o “COS” es aquel oligosacárido del quitosano que presenta cadenas cortas, preferiblemente de un tamaño <1-10 KDa, obtenido por la hidrólisis ácida o la rotura enzimática de los enlaces glicosídicos de las cadenas de quitosano, y que presenta efectos inhibidores del crecimiento de hongos y bacterias. Preferiblemente, el COS al que se refiere la presente invención es COS-5.44.

El término “inhibidor del gen ARL1” se refiere a una molécula que se une a dicho gen, a sus factores de transcripción o a cualquiera de sus productos de expresión, por ejemplo, aunque sin limitarnos, a la proteína Arl1, e inhibe o disminuye la expresión y/o actividad del factor al que se une y/o su señalización intracelular. Dicho inhibidor se selecciona de la lista que comprende, pero sin que sirva de limitación, antagonistas (preferiblemente químicos) , ARN de silenciamiento o anticuerpo específico para la proteína Arl1 (preferiblemente el anticuerpo es monoclonal) , en la presente invención este anticuerpo puede denominarse anticuerpo neutralizante del efecto de Arl1. Un ejemplo de inhibidor químico del gen ARL1 es, aunque sin limitarnos, el inhibidor GTP-GAMMA-S (Lee et al. 1997, J. BIOL CHEM., 272 (49) , 30998-31005) , un análogo de GTP no hidrolizable que actúa como inhibidor de ARL1 de forma dependiente de la concentración. Dicha acción inhibitoria se ve favorecida por la adición de fosfolípidos, en particular el DL-alfa-dimir y stoilphosphatidil-colina colato y también de detergentes (SDS) . Otros ejemplos de inhibidores de este tipo son, aunque sin limitarnos, los inhibidores de GTPasas MLS000532223 ó AMF-26 (J. BIOL. CHEM., 2012 287, 38885-97) .

Como se verá en los ejemplos, el análisis del transcriptoma de la célula eucariota que sobreexpresa el gen ARL1, célula que es resistente a COS, reveló que dicha célula presentaba también una reducción global en la producción de energía y un aumento en la proliferación celular en respuesta a la perturbación causada por COS en comparación con las células de tipo salvaje. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para bloquear ex vivo el ciclo celular y la transcripción en una célula eucariota. De esta manera, la composición de la invención es de utilidad para provocar, preferiblemente ex vivo, la muerte celular o la inhibición del crecimiento o de la proliferación en células eucariotas que se encuentren, por ejemplo, en cultivo.

Tal y como aquí se utiliza, el término “bloquear” se refiere a paralizar el ciclo celular y la transcripción en una célula eucariota. Dicho bloqueo se puede producir, por ejemplo, aunque sin limitarnos, a nivel de mitosis, meiosis, dinámica y modificación de la cromatina o esporulación en el caso de que la célula eucariota proceda de, por ejemplo, un hongo.

La expresión “ex vivo” se refiere a que la célula eucariota tratada con la composición de la invención se encuentra fuera del cuerpo humano o animal.

Además, los ejemplos de la presente invención demuestran que la sobreexpresión del gen ARL1 permite a las células eucariotas resistir ligeramente mejor, en comparación con las células control,... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende quitosano, o un oligosacárido de quitosano, y un inhibidor del gen ARL1 seleccionado de la lista que consiste en: ARN de silenciamiento, anticuerpo específico para la proteína Arl1, inhibidor GTP-GAMMA-S, inhibidor MLS000532223 o inhibidor AMF-26.

2. Uso de la composición según la reivindicación 1 como reactivo para bloquear ex vivo el ciclo celular y la transcripción en una célula eucariota.

3. Uso de la composición según la reivindicación 1 como reactivo para provocar ex vivo estrés oxidativo en una célula eucariota.

4. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3 donde la célula eucariota procede de un hongo o de un mamífero.

5. Uso de la composición según la reivindicación 4 donde la célula eucariota es una célula tumoral.

6. Uso de la composición según la reivindicación 1 como antifúngico.

7. Uso de la composición según la reivindicación 1 para la elaboración de un medicamento.

8. Uso de la composición según la reivindicación 7 donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de infecciones fúngicas.

9. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 en combinación con al menos otro compuesto antifúngico.

10. Uso de la composición según la reivindicación 9 donde el otro compuesto antifúngico es fluconazol.

11. Uso de una preparación combinada que comprende quitosano, o un oligosacárido de quitosano, y un inhibidor del gen ARL1 seleccionado de la lista que consiste en: ARN de silenciamiento, anticuerpo específico para la proteína Arl1, inhibidor GTP-GAMMA-S, inhibidor MLS000532223 o inhibidor AMF-26; por separado, simultáneo o secuencial, como antifúngico.

12. Uso de una preparación combinada que comprende quitosano, o un oligosacárido de quitosano, y un inhibidor del gen ARL1 seleccionado de la lista que consiste en: ARN de silenciamiento, anticuerpo específico para la proteína Arl1, inhibidor GTP-GAMMA-S, inhibidor MLS000532223 o inhibidor AMF-26; por separado, simultáneo o secuencial, para la elaboración de un medicamento.

13. Uso según la reivindicación 12, donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de infecciones fúngicas.

14. Composición según la reivindicación 1 que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otro principio activo.

15. Composición según la reivindicación 14 donde el otro principio activo es un compuesto antifúngico.

16. Composición según la reivindicación 15 donde el otro principio activo es fluconazol.

FIG. 1 FIG. 1 (Cont.) FIG. 1 (Cont.) FIG. 1 (Cont.) FIG. 2 FIG. 2 (Cont.) FIG. 2 (Cont.) FIG. 2 (Cont.)

FIG. 3

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