Células que expresan vitamina K epóxido reductasa y uso de las mismas.

Célula que contiene y expresa un ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica vitamina K epóxido reductasa (VKOR) operativamente asociada a un promotor heterólogo,

en la que dicho ácido nucleico que codifica VKOR comprende SEC ID NO:9, o un ácido nucleico que es al menos 80% idéntico a SEC ID NO:9, y en la que dicha VKOR expresada convierte vitamina K epóxido en vitamina K.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11156979.

Solicitante: UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA AT CHAPEL HILL.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 308 Bynum Hall Campus Box 4105 Chapel Hill, NC 27599 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: LI,TAO, STAFFORD,DARREL W.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N15/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Estabilización del vector.
  • C12N9/04 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2453895_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Células que expresan vitamina K epóxido reductasa y uso de las mismas Campo de la invención La presente invención se refiere a células hospedantes que contienen ácidos nucleicos aislados que codifican vitamina K epóxido reductasa (VKOR) , y a métodos de uso de las mismas.

Antecedentes de la invención La función de numerosas proteínas requiere la modificación de múltiples restos de ácido glutámico a !-carboxiglutamato. Entre éstas, las proteínas de coagulación dependientes de vitamina K (VKD) , FIX (factor Christmas) , FVII y protrombina son las mejor conocidas. La observación de que la genosupresión del gen de la proteína Gla de la matriz da como resultado la calcificación de las arterias del ratón (Luo et al. (1997) “Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA proteína” Nature 386:78-81) enfatiza la importancia del ciclo de la vitamina K para proteínas con funciones distintas de la coagulación. Además, Gas6 y otras proteínas Gla de función desconocida se expresan en el tejido neural, y la exposición a warfarina in utero da como resultado retraso mental y anomalías faciales. Esto es consistente con la observación de que la expresión de VKD carboxilasa, la enzima que consigue la modificación de Gla, está regulada temporalmente de una manera específica de tejido con alta expresión en el sistema nervioso durante las etapas embrionarias tempranas. De manera simultánea a la carboxilación, la vitamina K reducida, un cosustrato de la reacción, se convierte en epóxido de vitamina K. Debido a que la cantidad de vitamina K en la dieta humana es limitada, el epóxido de vitamina K debe convertirse de nuevo en vitamina K mediante la vitamina K epóxido reductasa (VKOR) para evitar su agotamiento. La warfarina, el fármaco anticoagulante más ampliamente usado, selecciona como diana la VKOR y evita la regeneración de la vitamina K. La consecuencia es una disminución en la concentración de vitamina K reducida, lo que da como resultado una tasa de carboxilación reducida mediante la !-glutamil carboxilasa y la producción de proteínas dependientes de vitamina K infracarboxiladas.

En los Estados Unidos de América solo, la warfarina se prescribe a más de un millón de pacientes al año, y en Holanda se ha dado a conocer que aproximadamente el 2% de la población está recibiendo una terapia con warfarina a largo plazo. Debido a que la dosis de warfarina requerida para un nivel terapéutico de anticoagulación varía enormemente entre los pacientes, la utilización de warfarina va acompañada de un riesgo significativo de efectos secundarios. Por ejemplo, se ha dado a conocer que tras el inicio de la terapia con warfarina se producían episodios de hemorragias importantes en 1-2% de los pacientes, y se producía la muerte en 0, 1-0, 7% de los pacientes. A pesar de los peligros, se ha estimado que el uso de warfarina puede prevenir 20 apoplejías por episodio de hemorragia inducida, y probablemente está utilizándose menos de lo debido por el miedo a la hemorragia inducida.

La presente invención resuelve los defectos previos en la técnica al proporcionar métodos y composiciones para correlacionar polimorfismos de un solo nucleótido en un sujeto con una sensibilidad mayor o menor a wuarfarina, permitiendo de ese modo una determinación más exacta y rápida de dosis terapéuticas y de mantenimiento de warfarina con un riesgo reducido para el sujeto.

Sumario de la invención La presente descripción enseña un método para identificar un sujeto humano que tiene una sensibilidad mayor o menor a warfarina, que comprende detectar en el sujeto la presencia de un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen de VKOR, en el que el polimorfismo de un solo nucleótido está correlacionado con una sensibilidad mayor o menor a warfarina, identificando de ese modo el sujeto que tiene una sensibilidad mayor o menor a warfarina.

Adicionalmente se proporciona un método para identificar un sujeto humano que tiene una sensibilidad mayor o menor a warfarina, que comprende: a) correlacionar la presencia de un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen de VKOR con una sensibilidad mayor o menor a warfarina; y b) detectar el polimorfismo de un solo nucleótido de la etapa a) en el sujeto, identificando de ese modo un sujeto que tiene una sensibilidad mayor o menor a warfarina.

En una realización adicional, la descripción enseña un método para identificar un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen de VKOR correlacionado con una sensibilidad mayor o menor a warfarina, que comprende:

a) identificar un sujeto que tiene una sensibilidad mayor o menor a warfarina;

b) detectar en el sujeto la presencia de un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen de VKOR; y

c) correlacionar la presencia del polimorfismo de un solo nucleótido de la etapa b) con la sensibilidad mayor o menor a warfarina en el sujeto, identificando de ese modo un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen de VKOR correlacionado con una sensibilidad mayor o menor a warfarina.

Además, la presente descripción se refiere a un método para correlacionar un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen de VKOR de un sujeto con una sensibilidad mayor o menor a warfarina, que comprende: a) identificar un sujeto que tiene una sensibilidad mayor o menor a warfarina; b) determinar la secuencia nucleotídica del gen de VKOR del sujeto de (a) ; c) comparar la secuencia nucleotídica de la etapa (b) con la secuencia nucleotídica de tipo salvaje del gen de VKOR; d) detectar un polimorfismo de un solo nucleótido en la secuencia nucleotídica de (b) ; y e) correlacionar el polimorfismo de un solo nucleótido de (d) con una sensibilidad mayor o menor a warfarina en el sujeto de (a) .

Un aspecto adicional de la presente descripción se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica vitamina K epóxido reductasa (VKOR) , particularmente VKOR de mamífero (por ejemplo, humana, ovina, bovina, de mono, etc.) . Los ejemplos incluyen (a) ácidos nucleicos como se describen aquí, tales como ácidos nucleicos aislados que tienen la secuencia nucleotídica como se expone en SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9; (b) ácidos nucleicos que se hibridan a ácidos nucleicos aislados de (a) anteriores o el complemento de los mismos (por ejemplo, en condiciones rigurosas) , y/o tienen identidad de secuencia sustancial con ácidos nucleicos de (a) anteriores (por ejemplo, son 80, 85, 90, 95 ó 99% idénticos a los ácidos nucleicos de (a) anteriores) , y codifican una VKOR; y (c) ácidos nucleicos que difieren de los ácidos nucleicos de (a) o (b) anteriores debido a la degeneración del código genético, pero codifican una VKOR codificada por un ácido nucleico de (a) o (b) anterior.

El término “rigurosa”, como se usa aquí, se refiere a condiciones de hibridación que son comprendidas habitualmente en la técnica para definir las materias primas del procedimiento de hibridación. Las condiciones de rigurosidad pueden ser bajas, elevadas o medias, como esos términos son conocidos habitualmente en la técnica y son bien reconocidos por el experto normal. Las condiciones de hibridación de rigurosidad elevada que permitirán a secuencias nucleotídicas homólogas hibridarse a una secuencia nucleotídica como se da aquí son bien conocidas en la técnica. Como ejemplo, la hibridación de tales secuencias a las moléculas de ácido nucleico descritas aquí se puede llevar a cabo en 25% de formamida, 5X SSC, 5X de disolución de Denhardt y 5% de sulfato de dextrano a 42ºC, con condiciones de lavado de 25% de formamida, 5X SSC y 0, 1% de SDS a 42ºC, para permitir la hibridación de secuencias de alrededor de 60%de homología. Otro ejemplo incluye condiciones de hibridación de 6X SSC, 0, 1% de SDS a alrededor de 45ºC, seguido de condiciones de lavado de 0, 2X SSC, 0, 1% de SDS a 50-65ºC. Otro ejemplo de condiciones rigurosas está representado por una rigurosidad de lavado de 0, 3 M de NaCl, 0, 03M de citrato de sodio, 0, 1% de SDS a 60-70ºC usando un ensayo de hibridación estándar (véase SAMBROOK et al., EDS., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2ª ed. (Cold Spring Harbor, NY 1989) . En diversas realizaciones, las condiciones rigurosas pueden incluir, por ejemplo, condiciones muy rigurosas (es decir, rigurosidad elevada) (por ejemplo, hibridación a ADN unido al filtro en 0, 5 M de NaHPO4, 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS) , 1 mM de EDTA a 65ºC, y un lavado en 0, 2xSSC/0, 1% de SDS a 68ºC) , y/o condiciones moderadamente rigurosas (es decir, rigurosidad media) (por ejemplo, lavado en 0, 2xSSC/0, 1% de SDS a 42ºC) .

Un aspecto adicional de la presente descripción se refiere a un ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica vitamina K epóxido reductasa... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Célula que contiene y expresa un ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica vitamina K epóxido reductasa (VKOR) operativamente asociada a un promotor heterólogo, en la que dicho ácido nucleico que codifica VKOR comprende SEC ID NO:9, o un ácido nucleico que es al menos 80% idéntico a SEC ID

NO:9, y en la que dicha VKOR expresada convierte vitamina K epóxido en vitamina K.

2. Célula de la reivindicación 1, en la que dicha VKOR expresada es sensible a warfarina.

3. Célula de la reivindicación 1 ó 2, que expresa además ácido nucleico que codifica una proteína dependiente de vitamina K y que contiene y expresa un ácido nucleico heterólogo que codifica una carboxilasa dependiente de vitamina K.

4. Célula de la reivindicación 3, en la que la proteína dependiente de vitamina K se selecciona del grupo que consiste en Factor VII, Factor IX, Factor X, Proteína C, Proteína S y protrombina.

5. Un método para obtener una proteína dependiente de vitamina K, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 3 ó 4 en presencia de vitamina K.


 

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