PROTEINAS DE UNIÓN A GAG.

La presente invención se refiere a métodos y herramientas para la inhibición de la interacción de las quimoquinas y sus receptores de alta afinidad sobre los leucocitos, y a métodos para el tratamiento terapéutico de las enfermedades inflamatorias. Las quimoquinas, derivadas originalmente de las citoquinas quimioatrayentes, actualmente comprenden más de 50 miembros y representan una familia de proteínas pequeñas, inducibles y secretadas de bajo peso molecular (6 a 12 kDa en su forma monomérica) que desempeñan un papel decisivo durante la inmunovigilancia y los procesos inflamatorios. Dependiendo de su función en la inmunidad y la inflamación, pueden agruparse en dos clases. Las quimoquinas inflamatorias son producidas por células de muchos tejidos diferentes, así como por leucocitos inmigrantes en respuesta a toxinas bacterianas y citoquinas inflamatorias como IL-1, TNF e interferones. Su función principal es reclutar leucocitos para la defensa del huésped, y en el proceso de la inflamación. Las quimoquinas de alojamiento, por otra parte, se expresan constitutivamente en áreas definidas de los tejidos linfoides. Dirigen el tráfico y alojamiento de linfocitos y células dendríticas dentro del sistema inmunológico. Estas quimoquinas, tal como se ilustra mediante BCA-1, SDF-1 ó SLC, controlan la relocalización y recirculación de los linfocitos en el contexto de la maduración, diferenciación y activación, y garantizan su alojamiento correcto dentro de los órganos linfoides secundarios. A pesar del gran número de representantes, las quimoquinas muestran pliegues estructurales notablemente similares, aunque la homología de secuencia varía entre el 20 y el 70 por ciento. Las quimoquinas consisten de aproximadamente 70 a 130 aminoácidos con cuatro residuos conservados de cisteína. Las cisteínas forman dos enlaces disulfuro (Cys 1Cys 3, Cys 2Cys 4) que son responsables de su estructura tridimensional característica. Las citquinas quimiotácticas consisten de un dominio aminoterminal corto (3 a 10 aminoácidos) que precede al primer residuo de cisteína, un núcleo formado de cadenas ß y bucles conectores presentes entre el segundo y cuarto residuos de cisteína, así como una hélice carboxi-terminal de 20 a 60 aminoácidos. El núcleo de proteína presenta una estructura bien ordenada, mientras que las partes N-terminal y C-terminal se encuentran desordenadas. Al igual que las proteínas secretorias, se sintetizan con una secuencia líder de 20 a 25 aminoácidos que se escinde antes de la liberación. Las quimoquinas se han subdividido en cuatro familias basándose en la posición relativa de sus residuos cisteína en la proteína madura. En la subfamilia de las quimoquinas , las primeras dos de las cuatro cisteínas se encuentran separadas por un único aminoácido (CXC), mientras que en las quimoquinas ß, los residuos cisteína correspondientes son contiguos (CC). Las quimoquinas pueden clasificarse adicionalmente en aquéllas que contienen la secuencia ELR en el extremo N-terminal, siendo de esta manera quimiotácticas para los neutrófilos (IL-8, por ejemplo), y aquéllas que carecen del motivo ELR y que actúan sobre los linfocitos (I-TAC, por ejemplo) Estructuralmente, las quimoquinas ß pueden subdividirse en dos familias: la familia de la proteína quimioatrayente de monocitos eotaxina, que contiene las cinco proteínas quimioatrayentes de monocitos (MCP) y la eotaxina, que son aproximadamente 65 por ciento idénticas entre sí, y las quimoquinas ß restantes. Al igual que la familia de CXC, los aminoácidos N-terminales que preceden a los residuos CC son componentes críticas para la actividad biológica y la selectividad de leucocitos de las quimoquinas. Las quimoquinas ß, en general, no actúan sobre los neutrófilos pero atraen a los monocitos, eosinófilos, basófilos y linfocitos con selectividad variable. Sólo unas cuantas quimoquinas encajan en la familia de CC o de CXC. La linfotactina es hasta el momento la única quimoquina que muestra sólo dos, en lugar de las cuatro, cisteínas características, en su estructura primaria, y de esta manera se clasifica como quimoquina Y o como quimoquina C. Por otra parte, concluyendo esta clasificación, debe mencionarse la fractalquina como único representante de la subfamilia de o CXXXC, con tres aminoácidos que separan las dos primeras cisteínas. Las dos, la linfotaxina y la fractalquina, inducen la quimiotaxis de las células T y de las células asesinas naturales. Las quimoquinas inducen la migración y activación celulares al unirse a una superficie celular específica, siente receptores transmembranales (7TM) acoplados a proteína G sobre las células diana. Hasta el momento se han clonado dieciocho receptores de quimoquina, entre ellos seis receptores CXC, diez CC, un CX3C y un XC. Los receptores de quimoquina se expresan sobre diferentes tipos de leucocitos, algunos de ellos restringidos a determinadas células (por ejemplo CXCR1 se restringe a los neutrófilos), mientras que otros se expresan más ampliamente (por ejemplo CCR2 se expresa sobre monocitos, células T, células asesinas naturales y basófilos). De manera similar a las quimoquinas, los receptores pueden expresarse constitutivamente sobre determinadas células, mientras que algunas son inducibles. Algunas de ellas incluso pueden regularse negativamente, provocando que las células no responden a una quimoquina determinada pero sigan siendo sensibles a otra. La mayoría de receptores reconoce más de una quimoquina y viceversa, aunque el reconocimiento se restringe a quimoquinas de la subfamilia correspondiente (ver la Tabla 1). Tabla 1 Quimoquina Receptor Quimiotáctico para 2 Enfermedades inflamatorias   Quimoquina CXC (+motivo ELR) Quimoquina CC IL-8 CXCR1 CXCR2 Neutrófilos MCP-1 CCR2 RANTES CCR1 CCR3 3 Basófilos; Monocitos; células T activadas; células dendríticas; células asesinas naturales Eosinófilos; Monocitos; Células T activadas; células dendríticas cells Eosinófilos; Basófilos; células dendríticas Monocitos; células T activadas CCR5 Células dendríticas; Células asesinas naturales Síndrome del distrés respiratorio Agudo [71]; Neumonía bacteriana [72]; Artritis reumatoide [73]; Enfermedad intestinal inflamatoria [74]; Soriasis [75]; Meningitis bacteriana [76] Asma [77]; Glomerulonefritis [78]; Ateroesclerosis [79]; enfermedad intestinal inflamatoria [80]; Soriasis [81]; Meningitis bacteriana y vírica [82,83] Asma [84];Glomerulonefritis [85] Las quimoquinas presentan dos sitios principales de interacción con sus receptores, uno en el dominio aminoterminal y el otro dentro de un bucle expuesto del esqueleto que se extiende entre el segundo y el tercer residuo de cisteína. Ambos sitios son mantenidos en estrecha proximidad por los enlaces disulfuro. El receptor reconoce el primer sitio de unión dentro de la región de bucle que aparentemente funciona como un dominio de anclaje. Esta interacción restringe la movilidad de la quimoquina, facilitando de esta manera la orientación correcta del dominio aminoterminal. Se han llevado a cabo estudios con quimoquinas mutantes que todavía se unían con efectividad a sus receptores pero que no señalizaban. Se obtuvieron estos mutantes mediante deleción o modificación de aminoácidos dentro de los extremos N-terminales de, por ejemplo, IL-8, RANTES y MCP-1. Las múltiples rutas intracelulares de señalización se producen tras la activación de receptores como resultado de la unión de quimoquinas. Las quimoquinas también interactúan con dos tipos de moléculas no señalizadoras. Una es el receptor DARC, que se expresa en eritrocitos y sobre células endoteliales y que se une a CC, así como a quimoquinas CXC, impidiendo su circulación. El segundo tipo son los glucosaminoglucanos heparán sulfato (GAGs), que son parte de los proteoglicanos y que sirven como correceptores de las quimoquinas. Capturan y presentan las quimoquinas sobre la superficie del tejido de alojamiento (por ejemplo las células endoteliales) con el fin de establecer un gradiente local de concentraciones. En una respuesta inflamatoria, tal como en la artritis reumatoide, los leucocitos que ruedan sobre el endotelio en un proceso mediado por selectina se ponen en contacto con las quimoquinas presentadas por los proteoglicanos sobre la superficie celular. De esta manera, las integrinas de los leucocitos resultan activadas, lo que conduce a adhesión firme y extravasación. Los leucocitos reclutados resultan activados por las citoquinas inflamatorias locales y pueden quedar desensibilizadas frente a la señalización posterior de quimoquinas debido a la elevada concentración local de las mismas. Para mantener un gradiente de quimoquinas en el flujo sanguíneo del tejido, el receptor DARC funciona como sumidero del exceso de quimoquinas. Los proteoglicanos heparán sulfato (HS), que consisten de una proteína nuclear... [Seguir leyendo]

1. Método para modificar una región de unión a GAG (glucosaminoglicano) que es una hélice C-terminal de una quimoquina, caracterizado porque comprende las etapas de introducir por lo menos un aminoácido básico en dicha hélice C-terminal y/o delecionar por lo menos un aminoácido voluminoso y/o ácido en dicha hélice C-terminal, de manera que dicha quimoquina presenta una afinidad de unión a GAG de Kd 10 mM, preferentemente 1 mM, todavía más preferentemente 0,1 mM, y en el que la afinidad de unión a GAG de dicha quimoquina se encuentra incrementada en comparación con la afinidad de unión a GAG de la quimoquina de tipo salvaje respectiva. 2. Quimoquina modificada, caracterizada porque una región de unión a GAG que es una hélice C-terminal en dicha quimoquina se modifica mediante sustitución, la inserción de por lo menos un aminoácido seleccionado de entre el grupo que consiste de Arg, Lys e His, y/o la deleción de por lo menos un aminoácido con el fin de incrementar la cantidad relativa de aminoácidos básicos en dicha hélice C- terminal, y/o reducir la cantidad de aminoácidos voluminosos y/o ácidos en dicha hélice C-terminal, de manera que se incrementa la afinidad de unión a GAG de dicha quimoquina en comparación con la afinidad de unión a GAG de la quimoquina de tipo salvaje respectiva. 3. Quimoquina modificada según la reivindicación 2, caracterizada porque la quimoquina es IL-8, RANTES o MCP-1. 4. Quimoquina modificada según la reivindicación 2, caracterizada porque la quimoquina es SDF-1, MGSA/GRO, MIP2/ GROß, NAP-2, PF-4, MCP-2, MCP-3, MIP-1, MIP-1ß, MPIF-1 ó MIP-5/HCC-1. 5. Quimoquina modificada según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracteizada porque la afinidad de unión a GAG incrementada es una afinidad de unión incrementada a heparán sulfato y/o a heparina. 6. Quimoquina modificada según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizada porque una región biológicamente activa adicional se modifica, inhibiendo o regulando negativamente de esta manera una actividad biológica adicional de dicha proteína. 7. Quimoquina modificada según la reivindicación 6, caracterizada porque dicha región biológicamente activa adicional se modifica mediante deleción, inserción y/o sustitución preferentemente con alanina, un residuo estérica y/o electrostáticamente similar. 8. Quimoquina modificada según la reivindicación 6 ó 7, caracterizada porque dicha actividad biológica adicional es la activación de los leucocitos. 9. Molécula aislada de ácido polinucleico, caracterizada porque codifica una quimoquina según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8. 10. Vector, caracterizado porque comprende una molécula aislada de ADN según la reivindicación 9. 11. Célula recombinante que comprende un ácido polinucleico según la reivindicación 9, en la que la célula recombinante no es de origen humano. 12. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una quimoquina según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, un ácido polinucleico según la reivindicación 9 ó un vector según la reivindicación 10, y un portador farmacéuticamente aceptable. 13. Quimoquina según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, un ácido polinucleico según la reivindicación 9 ó un vector según la reivindicación 10, destinada al tratamiento de una condición inflamatoria, en la que la quimoquina se selecciona de entre el grupo que consiste de IL-8, MGSA/GRO, MIP2alpha, GROß, NAP-2, PF-4, SDF-1, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-1, MIP-1ß, MPIF-1 y MIP-5. 14. Quimoquina según la reivindicación 13, caracterizada porque la condición inflamatoria se selecciona de entre un grupo que comprende artritis reumatoide, soriasis, osteoartritis, asma, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple. --- 37   38   39     41