METODO PARA LA DETECCION ESPECIFICA DE SALMONELLA SPP.
Procedimiento para la detección específica de la presencia de Salmonella spp.
en una muestra sospechosa de contener Salmonella spp. y que comprende además uno o más microorganismos adicionales, caracterizado por el hecho de que
(i): la muestra se analiza para identificar la presencia de un gen bipA (o typA) de Salmonella; y
(ii) la cantidad del gen bipA (o typA) de Salmonella presente en la muestra se evalúa y si la muestra comprende el gen bipA (o typA) de Salmonella, esto es una prueba de que Salmonella está presente en la muestra;
en el que el gen bipA (o typA) de Salmonella es un gen bipA (o typA) seleccionado del grupo de genes bipA (o typA) que consisten en:
(a) un gen bipA (o typA) que comprende una secuencia de ADN que es idéntica en al menos un 95% a la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 1-1824 de la SEC ID Nº 1 (denominada "bipA (o typA"));
(a1) un gen bipA (o typA) que codifica un polipéptido que es idéntico en al menos un 95% al polipéptido mostrado en las posiciones 1-607 de la SEC ID Nº 2 (denominada BipA (o TypA) GTPasa)
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/059603.
Solicitante: UNIVERSITAT DE GIRONA.
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: CALVO,LAIA, GARCIA-GIL,JESUS.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 16 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68M10B
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Fragmento de la descripción:
Método para la detección específica de Salmonela spp.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para la detección específica de la presencia de Salmonella en una muestra que es sospechosa de contener Salmonella, y que comprende además uno o más microorganismos adicionales.
Antecedentes
Salmonella es una bacteria gram negativa, en forma de bacillo que no forma esporas. El género Salmonella es un miembro de la familia Enterobacteriaceae, y engloba dos especies: Salmonella bongori y Salmonella enterica. S. enterica incluye seis subespecies de importancia clínica para los humanos que causan millones de casos de intoxicación alimentaria en el mundo cada año.
Se requieren hasta cinco días para detectar Salmonella por medio de los métodos tradicionales basados en cultivo. Por lo tanto, la necesidad de nuevos métodos rápidos y sensibles para detectar Salmonella es una preocupación principal en la seguridad alimentaria.
La detección de Salmonella se realiza actualmente tanto en muestras alimentarias como clínicas.
Las muestras alimentarias sospechosas de contener Salmonella incluyen, por ejemplo, huevo, ave de corral, carne cruda (poco hecha), marisco crudo, leche y productos lácteos, agua, salsas y aliños de ensaladas, etc.
En muestras clínicas, Salmonella puede obtenerse directamente a partir de, por ejemplo, heces de, por ejemplo, un ser humano.
Recientemente, la detección molecular por medio de técnicas basadas en PCR se ha convertido en un procedimiento común para la identificación rápida de Salmonella. Se han implementado protocolos tanto convencionales como modernos de PCR a tiempo real, fijando como objetivo un número de genes que contienen secuencias de identificación únicas.
Los métodos basados en PCR descritos hasta el momento, fijan como objetivo varios genes filogenéticos y funcionales incluyendo oligonucleótidos que se dirigen específicamente a regiones del operón ribosomal tales como la subunidad 16S (Lin y Tsen (1996) J Appl Bacteriol 80,659-666).
Sin embargo, los genes funcionales implicados en la virulencia e infectividad son actualmente los marcadores elegidos para la mayoría de los procedimientos por PCR. El gen más ampliamente usado hasta la fecha es invA (invasión A). El gen inv codifica un componente esencial del aparato de secreción proteica asociada a invasión, y es el primer gen del locus inv. Este locus permite que Salmonella spp. entre en las células epiteliales causando una infección (Galán, et al, (1992) J Bacteriol, 174,1338-4349). Otros autores usan genes como tyv, prt, viaB, flic-d o flic-a para detectar e identificar las serovariedades Typhi y Paratyphy de Salmonella enterica. Estos genes son genes de antígeno O, H y Vi (Hirose, et al, (2002) J Clin Microbiol 40, 633-636). Los genes del locus ttrRSBCA, que se requieren para la respiración de tetrationato y se localizan cerca de la isla de patogenicidad 2 de Salmonella, se usan también como una diana para detectar Salmonella en alimentos mediante PCR a tiempo real (Malorny, et al, (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70, 7046-7052).
Sin embargo, todos estos genes presentan problemas de amplificaciones no específicas así como problemas de inclusividad (Cohen, et al, (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62, 4303-4308).
El documento WO2005/090596 describe un ensayo para la identificación molecular de bacterias de acuerdo con la especificidad Gram, de género, de especie y de cepa mediante la detección de la presencia de genes marcadores definidos mediante PCR. La secuencia Spy1527 de Streptococcus pyogenes corresponde al gen typA y se usa como un gen marcador para bacterias Gram positivas.
Descripción resumida de la invención
El problema a resolver mediante la presente invención es proporcionar un método para detectar específicamente Salmonella.
La solución se basa en que los presentes inventores han identificado que un gen específico de Salmonella conocido por el término BipA (o typA) comprende suficientes secuencias específicas empleables para detectar específicamente Salmonella en una muestra, que comprende además uno o más microorganismos adicionales tales como una o más especies adicionales además de Salmonella.
El gen bipA (o typA) pertenece a "la familia de elongación de unión a GTP" de genes, categoría N. Los genes bipA (o typA) se conocen en diferentes organismos tales como, por ejemplo, E. coli y Bordetella spp. También se sabe que están presentes en Salmonella (véase posteriormente para más detalles). La inducción de bipA (o typA) permite la modulación de una serie de procesos aguas abajo incluyendo el metabolismo de ADN y la secreción tipo III. Un gen "regulador global" tal como bipA (o typA) es crítico para el crecimiento celular y puede denominarse gen "constitutivo". El experto en la materia sabe que tales genes "constitutivos" están generalmente bastante conservados entre diferentes especies de un género. Sin embargo, como se ha dicho anteriormente, sorprendentemente el gen bipA (o typA) de Salmonella como se describe en la presente memoria comprende suficientes secuencias específicas empleables para distinguir específicamente Salmonella de otras especies diferentes. Véanse, por ejemplo, los resultados 2.3 de los ejemplos de trabajo de la presente memoria, en los que se demuestra que Salmonella puede distinguirse específicamente de varios otros microorganismos relevantes. Los resultados proporcionados en la sección de resultados 2.3 se basan en PCR a tiempo real que usa ADN genómico y cebadores orientados hacia un gen bipA (o typA) de Salmonella como se describe en la presente memoria.
Además, los genes funcionales como los listados en la sección de antecedentes anterior están sometidos normalmente a alta variabilidad, principalmente debido a mutaciones silenciosas en la tercera base del codón. Esto quiere decir que en, por ejemplo, un oligonucleótido de 21 pares de bases, hasta siete posiciones pueden ser no específicas, debido a la variabilidad genética natural de las poblaciones bacterianas, lo que puede comprometer la especificidad del sistema de PCR. Por alguna razón, el gen bipA (o typA), como se discute en la presente memoria, no muestra esta variabilidad, haciéndolo una diana ideal debido a su secuencia altamente conservada.
La secuencia genómica completa de la serovariedad Typhimurium LT2 de Salmonella enterica se describe en [McClelland, et al, (2001), Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2., Nature, 413, 852-856]. La secuencia genómica de la serovariedad Typhi CT18 de Salmonella enterica se describe en [Parkhill, et al, (2001), Complete genome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi CT18. Nature, 413, 848-852]. La secuencia genómica completa de la serovariedad Choleraesuis de Salmonella enterica se describe en [Chiu, et al, (2005), The genome sequence of Salmonella enterica serovar Choleraesuis, a highly invasive and resistant zoonotic pathogen. Nucl. Ac. Res., 33, 1690-1698]. Estas secuencias genómicas completas tienen los números de acceso GenBank AE006468, AL513382, y AE017220, respectivamente. El gen bipA (o typA) de Salmonella descrito en la presente memoria se describe en [Kinsella, et al, (2000) Characterisation of the bipA (or typA) gene of Salmonella typhimurium. Unpublished]. El gen bipA (o typA) tiene el número de acceso GenBank: "STY276889 REGION: 12..1845" y la secuencia de ADN se muestra en SEC ID Nº 1. La secuencia de aminoácidos correspondiente se denomina en la presente memoria BipA (o typA) GTPasa y tiene la ID proteínica: CAC 14270.1 y la secuencia de aminoácidos se muestra en SEC ID Nº 2.
El experto sabe que pueden existir algunas diferencias de secuencia relativamente menores entre los genes similares dentro de diferentes subespecies (o serovariedades) de una especie de interés (aquí Salmonella). Basándose en el conocimiento general habitual y las técnicas bioinformáticas disponibles actualmente, es rutinaria para un experto la identificación de dichas diferencias de secuencias...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para la detección específica de la presencia de Salmonella spp. en una muestra sospechosa de contener Salmonella spp. y que comprende además uno o más microorganismos adicionales, caracterizado por el hecho de que
en el que el gen bipA (o typA) de Salmonella es un gen bipA (o typA) seleccionado del grupo de genes bipA (o typA) que consisten en:
2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el o los otros microorganismos comprendidos dentro de la muestra son uno o más microorganismos seleccionados del grupo que consiste en otras especies que no son Salmonella spp. tales como E. coli, Shigella, Enterobacter, Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, Pseudomonas, Serratia, Proteus, Enterococcus, Arthrobacter y Listeria.
3. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra es una muestra alimentaria, preferiblemente en el que la muestra alimentaria es huevo, ave de corral, carne cruda (poco hecha), marisco crudo, leche y productos lácteos, agua, salsas y aliños de ensalada.
4. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el gen bipA (o typA) de Salmonella es un gen bipA (o typA) seleccionado de un grupo de genes bipA (o typA) que consiste en:
5. Procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el análisis para identificar la presencia de un gen bipA (o typA) de Salmonella o con etapa (i) del método se realiza mediante una técnica de amplificación génica adecuada [por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), NASBA (amplificación basada en secuencia de ácido nucleico) o amplificación por desplazamiento de cadena (SDA)] para amplificar el gen relevante y en el que la técnica de amplificación se realiza de una manera en la que es capaz de amplificar específicamente el gen bipA (o typA) de Salmonella y no amplifica cantidades medibles de secuencias génicas bipA (o typA) del o de los otros microorganismos comprendidos adicionalmente dentro de la muestra.
6. Procedimiento de la reivindicación 5, en el que la técnica de amplificación génica adecuada es PCR (preferiblemente PCR a tiempo real) y en el que los cebadores de PCR se construyen de manera que los cebadores de PCR amplifican específicamente el gen bipA (o typA) de Salmonella analizado y no amplifican cantidades medibles de secuencias génicas bipA (o typA) del o de los otros microorganismos comprendidos adicionalmente dentro de la muestra.
7. Procedimiento de la reivindicación 6, en el que los cebadores de PCR son al menos un cebador seleccionado del grupo de cebadores de PCR que consiste en:
| SEC ID Nº 3 (denominada SAL1504_F): | 5'-TTC GGT TTG CAG GAT CG-3'; |
| SEC ID Nº 4 (denominada SAL1704_R): | 5'-CGC TTG CTC AAG ACT CAT TTT A-3'; |
| SEC ID Nº 5 (denominada SAL1410_F): | 5'-GGT CTG CTG TAC TCC ACC TTC AG-3'; |
| SEC ID Nº 6 (denominada SAL1494_R): | 5'-TTG GAG ATC AGT ACG CCG TTC T-3': y |
| SEC ID Nº 7 (denominada SAL1441_PR): | 5'-TTA CGA CGA TAT TCG TCC GGG TGA AGT G-3'. |
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